黃藝爍，謝學(xué)文，石延霞，柴阿麗，李 磊，李寶聚

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

番茄匍柄霉葉斑病致病菌包括茄匍柄霉Stemphylium solaniWeber和番茄匍柄霉Stemphylium lycopersici（Enjoji）Yamamoto[1]，主要危害番茄葉片，嚴重時蔓延至莖蔓、果實。病斑初為褐色小點，逐漸擴大呈圓形或近圓形，發(fā)病后期易穿孔破裂，造成嚴重損失[2]?，F(xiàn)階段該病害的防治措施主要依賴化學(xué)防治，但大量施用化學(xué)農(nóng)藥造成如農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、菌株抗藥性等問題日益凸顯。近年來，生物防治由于其安全性及高效、經(jīng)濟、環(huán)保等優(yōu)點，已成為研究熱點[3]。

假單胞菌屬Pseudomonasspp.細菌廣泛分布于植物根際土壤，可以產(chǎn)生多種具有抑菌作用的次生代謝物，包括吩嗪類物質(zhì)、藤黃綠膿菌素（pyoluteorin，Plt）、硝吡咯菌素（pyrrolntrin，Prn）、2,4-DAPG（2,4-diacetylphloroglueinol，Phl）、脂多肽類及其衍生物等，在防治病害中發(fā)揮著重要作用[4]。此外，假單胞菌還可以產(chǎn)生植物激素IAA、嗜鐵素等物質(zhì)，促進植物的生長[5]，因而受到各國研究者的關(guān)注，是國內(nèi)外研究最早、報道最多的一類生防菌[6]。多年來，有關(guān)假單胞菌屬生物防治的研究多集中在其根際促生作用上[7]，而近年來一些學(xué)者用假單胞菌成功防治了小麥[8]、草莓[9]、小白菜[10]和番茄[11]等多種植物的侵染性病害，極大地擴展了假單胞菌的應(yīng)用范圍。目前，利用生防假單胞菌防治番茄匍柄霉葉斑病鮮有報道，本研究采集番茄匍柄霉葉斑病發(fā)病地塊土壤，旨在分離獲得對番茄匍柄霉具有高效拮抗作用的菌株。

本文采用稀釋涂布平板法，從四川番茄根際土壤分離篩選到一株具有廣譜拮抗活性的生防細菌YS05，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、Biolog測定和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，明確了其分類地位，初步揭示其生防作用機理。同時測定了該菌株產(chǎn)抗生素能力、揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性及在離體和活體盆栽條件下對番茄匍柄霉防治效果，為該菌株的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試番茄品種 番茄品種“齊達利”，購于先正達生物科技（中國）有限公司。

1.1.2 供試菌株 番茄匍柄霉菌Stemphylium lycopersici（Enjoji）Yamamoto、炭疽菌Colletotrichumspp.、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、多主棒孢菌Corynespora cassiicola、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、茄病鐮刀菌Fusarinm solani、茄鏈格孢菌Alternaria solani、西瓜殼二孢Ascochyta citrullina、密執(zhí)安棒桿菌密執(zhí)安亞種Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis、葡萄土壤桿菌Agrobacterium vitis、丁香假單胞番茄致病變種Pseudomonas syringaepv. tomato，以上菌株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分離并保存。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 King′s B培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g，甘油10.0 mL，MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0±0.2；Nutrient Broth培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉 3.0 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0±0.2； Potato Dextrose Agar培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1000 mL；WA培養(yǎng)基：5 g瓊脂，1000 mL蒸餾水。

1.1.4 供試藥劑 50%異菌脲可濕性粉劑，江蘇省蘇州富美實植物保護劑有限公司生產(chǎn)（登記號：PD20151441）；8億芽胞/g蠟質(zhì)芽胞桿菌可濕性粉劑，山東泰諾藥業(yè)有限公司（登記證：PD20094534）；80億芽胞/mL地衣芽胞桿菌水劑，廣西金燕子農(nóng)藥有限公司（登記證號：PD20140122）；46%氫氧化銅水分散粒劑，美國杜邦公司（登記證號：PD20110053）；33.5%喹啉銅懸浮劑，山東奧勝生物科技有限公司（登記證號：PD20200743）；10%多抗霉素可濕性粉劑，山東省德州祥龍生化有限公司（登記證號：PD20100857）；50%異菌脲可濕性粉劑，江蘇省蘇州富美實植物保護劑有限公司（登記號：PD20151441）。

1.2 拮抗菌株分離、純化

采集四川健康番茄植株根際土壤，采用稀釋涂布平板法[12]，將土壤樣品進行梯度稀釋，取100 μL稀釋濃度為10-4、10-5、10-6的懸浮液涂布于KB固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h[13]。對單菌落進行劃線純化3～5次，待菌落形態(tài)穩(wěn)定后保存?zhèn)溆肹14]。

1.3 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙法測定上述分離純化細菌對番茄匍柄霉的抑制率[15]。在PDA平板中心放置一個直徑5 mm的番茄匍柄霉菌餅，采用十字交叉法將5 μL OD600為0.8待測菌株菌懸液滴加距皿中心2.5 cm處，以不加待測菌株為對照，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，每處理 3次重復(fù)。待空白對照菌株生長至平板邊緣進行調(diào)查，用抑制率表示[16]。抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.4 菌株YS05的鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)特征觀察及生理生化指標(biāo)測定 使用滅菌牙簽挑取菌株YS05單菌落接種于KB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h。菌株形態(tài)特征觀察和生理生化指標(biāo)測定參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定書冊》[17]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]。

1.4.2 Biolog測定 挑取YS05單菌落接種至KB培養(yǎng)基試管斜面上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，使用BIOLOG GENⅢ試劑盒（按照試劑盒說明書操作）對其進行唯一碳源利用的測定。

1.4.3 菌株YS05多基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 利用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒，小量提取菌株YS05基因組DNA為模板，選擇16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD等保守基因進行PCR擴增并測序[19]（表1）。所得PCR產(chǎn)物由北京博邁德生物公司進行測序。使用MEGA 7.0、Sequence Matrix、Seaview4等軟件對測序結(jié)果進行分析，構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)進化樹，分析其分類地位[14]。

表1 構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹引物信息Table 1 Primers of phylogenetic tree

1.5 菌株YS05抑菌譜測定

采用平板對峙法測定菌株YS05對9種病原真菌抑制效果，操作步驟同1.3。采用雙層培養(yǎng)法[21]測定菌株YS05對3種病原細菌抑制效果。將5 μL OD600為0.8的菌株YS05菌懸液接種在KB平板中心，28 ℃培養(yǎng)24 h后用3 mL氯仿熏蒸滅活，使用5 mL含有病原細菌的WA培養(yǎng)基作為上層。28 ℃培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈直徑，計算抑菌率，每個處理 3次重復(fù)。抑制率（%）＝（對照菌落直徑—處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.6 菌株YS05生防機制分析

1.6.1 蛋白酶的檢測 在脫脂牛奶培養(yǎng)基中心位置接種5 μL OD600為0.8的菌株YS05菌懸液，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察消解圈。每個處理3次重復(fù)[22]。

1.6.2 HCN的檢測 Whatman濾紙剪成5 mm×25 mm的紙條，分別稱取25 mg copper (Ⅱ) ethylacetoacetate和25 mg 4-4’-methylenebis-(N, N-dimethylaniline)溶于10 mL氯仿中，鑷子滅菌后將Whatman濾紙條在上述溶液中完全浸濕，晾干，于9 cm玻璃培養(yǎng)皿中保存?zhèn)溆肹12]。

1.6.3 抗生素耐受性測定 測定菌株YS05對10種抗生素的耐受性（表2），在15 mL無菌管中加入3 mL含抗生素KB液體培養(yǎng)基，接種1% OD600為0.8的菌株YS05菌懸液于搖菌管中，設(shè)置未加抗生素空白對照，搖培24 h，觀察菌株對抗生素的耐受性，每個處理3次重復(fù)[23]。

表2 抗生素溶液配制Table 2 Preparation of antibiotic solution

1.6.4 菌株YS05抗生素基因特異性引物擴增 為分析菌株YS05合成抗生素能力，選擇吩嗪、2,4-DAPG、硝吡咯菌素、藤黃綠膿菌素、2-羥基吩嗪等抗生素合成基因特異性引物進行PCR擴增（表3），PCR程序和條件參照相應(yīng)文獻。利用熒光假單胞菌2P24作為對照，PCR產(chǎn)物測序驗證與抗生素生物合成序列一致性[26]。

表3 抗生素基因及引物序列信息Table 3 Antibiotic gene and primer sequence information

1.7 菌株YS05揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性測定

取菌株YS05單菌落接種在液體KB培養(yǎng)基中，28 ℃搖培24 h，調(diào)整其OD600為0.8備用。在二分皿中加入PDA培養(yǎng)基，滅菌牙簽蘸取菌株YS05種子液平板一側(cè)劃線，對應(yīng)一側(cè)加入5 mm病原真菌菌餅，置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，未加生防菌作為對照[27]。觀察到空白對照病原菌生長至平板邊緣處進行調(diào)查，測定病原菌生長直徑并計算抑制率，每個處理重復(fù)3次。抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.8 菌株YS05與6種藥劑對番茄匍柄霉離體葉片防效測定

采用貼菌片法測定菌株YS05和其他6種藥劑對番茄匍柄霉離體葉片防效，測定步驟參照文獻[28]，將5 mm真菌菌餅置于番茄葉片正面，28 ℃、光暗交替條件下培養(yǎng)3 d。使用OD600為0.8的菌株YS05菌懸液稀釋100倍后噴霧接種于含真菌菌餅的番茄葉片上，清水作為空白對照，選擇6種對照藥劑測定對番茄匍柄霉離體防效。每個處理6個葉片，3次重復(fù)。處理后7 d調(diào)查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)和防治效果。按照《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則》中的病害分級標(biāo)準(zhǔn)，病情按病斑面積占葉片比例分級：0級為 0；1級為1%～5%；2級為6%～10%；3級為11%～25%；4級為26%～50%；5級為50%以上[29]。病情指數(shù)＝∑（各級病葉數(shù)×病級數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病級數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.9 菌株YS05防治番茄匍柄霉活體盆栽防治效果測定

采用噴霧接種法將15 mL濃度為1×108cfu/mL的番茄匍柄霉菌懸液接種于5片真葉的番茄幼苗上，于28 ℃下保濕24 h后，將OD600為0.8的菌株YS05菌懸液稀釋100倍后，噴霧接種于處理植株，以50%異菌脲可濕性粉劑和清水作為對照。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)處理8棵番茄幼苗，病情指數(shù)和防治效果計算方法參照1.8。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和繪圖，采用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離篩選

從四川健康番茄根際土壤中共分離獲得236株細菌，利用平板對峙法獲得23株對番茄匍柄霉具有抑制效果的拮抗細菌，對其編號為YS01～YS23。試驗結(jié)果表明，23株拮抗細菌對番茄匍柄霉具有一定的抑制效果，菌絲生長被抑制，其中菌株YS05抑制效果最高，抑制率達68.91%（表4）。

表4 23株假單胞菌對番茄匍柄霉拮抗效果測定Table 4 Inhibition rate of 23 strains of antagonistic bacteria against Stemphylium lycopersici in tomato

2.2 菌株YS05的鑒定

菌株YS05在KB平板中正面呈現(xiàn)乳白色，背面為淡黃色，電鏡下觀察菌株形態(tài)為桿狀，鞭毛單個極生，大小為（0.8～1.1）μm×（1.2～2.7）μm（圖1）。Biolog測定菌株YS05可利用α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖等碳源，不可利用3-Methyl 葡萄糖、肌苷、D-山梨醇、D-甘露醇等碳源。菌株YS05生理生化指標(biāo)的測定結(jié)果表明，菌株YS05的耐鹽性、明膠液化、V-P反應(yīng)、淀粉水解和硝酸鹽還原利用等試驗結(jié)果與綠針假單胞菌HL5-4和綠針假單胞菌Pa40的反應(yīng)特征一致，初步確定其為綠針假單胞菌屬細菌（表5）。

圖1 菌株YS05形態(tài)特征觀察Fig. 1 Observation on morphological of strain YS05

表5 生理生化特征鑒定結(jié)果Table 5 The physiological and biochemical reaction of bacterial strain YS05

經(jīng)PCR擴增后，得到菌株YS05 16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD基因序列，構(gòu)建YS05多基因系統(tǒng)進化樹，該菌株與綠針假單胞菌桔黃亞種模式菌株P(guān). chlororaphissubsp.aurantiacaLMG 21630聚在一個分支。結(jié)合形態(tài)和生理生化特征，鑒定菌株YS05屬于綠針假單胞菌桔黃亞種（圖2）。

圖2 菌株YS05基于16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD基因序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA, gyrB, rpoB and rpoD gene sequences of strain YS05

2.3 菌株YS05抑菌譜的測定

菌株YS05可以有效抑制灰葡萄孢菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉、立枯絲核菌、炭疽菌、茄鏈格孢菌和番茄匍柄霉菌等7種真菌抑制率大于50%，對茄病鐮刀菌和西瓜殼二孢抑制率分別為21.4%和7.73%。菌株YS05對病原細菌也有較好的抑制效果，對丁香假單胞番茄致病變種和葡萄根癌菌抑菌率均在50%以上（表6）。

表6 菌株YS05對病原菌的抑菌效果Table 6 The effects of strain YS05 on pathogens

2.4 菌株YS05生防機制分析

菌株YS05在脫脂牛奶培養(yǎng)基中有透明圈產(chǎn)生（圖3A）；接種菌株YS05離心管中試紙條變藍（圖3B），證明其代謝產(chǎn)物中含有蛋白酶和HCN。菌株YS05對氨芐青霉素、氯霉素、萬古霉素、羧芐青霉素、鏈霉素、奇霉素等抗生素耐受，對卡那霉素、利福平、四環(huán)素、慶大霉素等4種抗生素不耐受?？股靥禺愋砸颬CR擴增結(jié)果表明，菌株YS05含有編碼合成吩嗪-1-羧基（phenazine-1-carboxilic acid, PCA），硝吡咯菌素（pyrrolnitrin, Pln）基因，未擴增出2,4-DAPG（2, 4-diacetylphloroglucinol, DAPG）、藤黃綠膿菌素（pyoluteorin, Plt）和2-羥基吩嗪（2-hydroxylated phenazine, 2-OH-PHZ）基因（圖3C）。

圖3 菌株YS05生防機制分析Fig. 3 Analysis of biocontrol mechanism of strain YS05

2.5 菌株YS05揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性測定

測定菌株YS05揮發(fā)性物質(zhì)對病原真菌抑制效果結(jié)果表明，菌株YS05揮發(fā)性物質(zhì)對立枯絲核菌和西瓜殼二孢效果較好，抑制率分別為43.95%和49.53%，而對茄病鐮刀菌抑制率較低為10.43%（表7）。

表7 菌株YS05揮發(fā)性物質(zhì)抑制效果Table 7 Inhibitory effect of volatile compounds of strain YS05

2.6 菌株YS05與6種藥劑對番茄匍柄霉離體葉片防效

菌株YS05菌懸液和6種藥劑對番茄匍柄霉離體葉片的防治試驗結(jié)果表明，7個處理的病情指數(shù)均顯著低于清水對照，菌株YS05菌懸液稀釋100倍液后，對番茄匍柄霉葉斑病防治效果達到71.52%，顯著高于其他6種藥劑防治效果（P＜0.05）（表8）。

表8 菌株YS05與6種藥劑對番茄匍柄霉離體葉片防效Table 8 Control efficiency of YS05 strain against gray leaf spot of tomato

2.7 菌株YS05防治番茄灰葉斑匍柄霉活體盆栽防治效果

清水對照處理接種番茄匍柄霉菌7 d后葉片上出現(xiàn)明顯的病斑，菌株YS05菌懸液稀釋100倍液后，對番茄匍柄霉葉斑病的防治效果達到61.27%，顯著高于藥劑對照50%異菌脲可濕性粉劑處理防效57.68%（P＜0.05）（表9）。

表9 菌株YS05對番茄匍柄霉盆栽防效測定Table 9 Control efficiency of strain YS05 against gray leaf spot of tomato by potted test

3 討論

本研究從四川健康番茄植株根際土壤中分離到一株對番茄匍柄霉菌具有良好拮抗效果的生防細菌YS05，經(jīng)鑒定屬于綠針假單胞菌桔黃亞種。綠針假單胞菌桔黃亞種屬于假單胞菌屬、綠針假單胞菌種細菌[30]，

據(jù)報道綠針假單胞菌桔黃亞種對多種植物病害均有較好的防治效果。Jiao等[12]分離獲得一株綠針假單胞菌桔黃亞種Pa40，可有效控制小麥紋枯病致病菌禾谷絲核菌Rhizoctonia cereali的生長；Rovera等[31]發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌桔黃亞種SR1可有效地抑制大豆炭腐病Macrophomina phaseolina的發(fā)生，并顯著增加大豆莖、根長度及莖和根的干重；Hu等[32]從小麥田中分離獲得一株可高產(chǎn)PCN的菌株P(guān)cho10，可防治小麥赤霉病Fusarium graminearum。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株YS05對9種病原真菌和3種病原細菌在離體條件下均有抑制效果，已報道綠針假單胞菌常用于防治真菌性病害，鮮有對細菌性病害具有防治效果，因此該生防菌具有一定的開發(fā)潛力。

生防菌防治植物病害主要的作用機理為抗生作用、營養(yǎng)和位點競爭及誘導(dǎo)植物抗性等[33]。不同的菌株產(chǎn)生的抗生素的種類和數(shù)量可能會不同，因此不同的假單胞菌對不同的病原菌具有抑制活性，且抑制程度也不相同[34]。綠針假單胞菌Pa40含有編碼參與吩嗪-1-羧酸、2-羥基吩嗪和硝吡咯菌素等合成基因[12]；菌株2P24和CPF-10中均可擴增到抗生素2,4-DAPG[12]；假單胞菌M18可分泌吩嗪-1-羧酸PCA，有效抑制黃瓜枯萎病菌及多種植物病原菌菌絲的生長[35]。本研究中菌株YS05擴增到含有編碼吩嗪-1-羧酸和硝吡咯菌素等合成基因，結(jié)合菌株全基因組測序結(jié)果，使用antismash比對發(fā)現(xiàn)該菌株有18個次生代謝物合成基因簇（數(shù)據(jù)未發(fā)表），從基因?qū)用嫔辖忉屃嗽摼昕捎行б种贫喾N病原菌的原因。

目前，微生物揮發(fā)性物質(zhì)的研究仍處于發(fā)展階段，郭潔心等[36]利用平板對扣法測定解淀粉芽胞桿菌XJ5揮發(fā)性化合物可有效抑制蘋果褐腐病菌Monilinia fructigena等多種病原菌病斑擴展和菌絲生長；楊藝煒等[37]從土壤樣品中篩選出一株綠針假單胞菌 XF10，其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可有效抑制煙草黑脛病菌菌絲的生長；馮福山等[38]測定枯草芽胞桿菌4種揮發(fā)性化合物對油茶病原真菌均具有較好的抑菌活性，抑菌活性壬醛＞苯甲醛＞3-甲基-4-苯基吡唑＞苯丙噻唑。本研究采用二分皿法測定了綠針假單胞菌桔黃亞種 YS05揮發(fā)性物質(zhì)對 8種病原菌的抑制效果，均具有一定的抑制效果，后續(xù)將采用頂空固相微小萃取技術(shù)（HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對其揮發(fā)性物質(zhì)成分進行分析，為該菌株的開發(fā)提供理論依據(jù)。

番茄匍柄霉葉斑病由于其發(fā)病機制和宿主抗病機理不明確[39]，缺乏抗性基因和有效的化學(xué)防治措施[40]，給農(nóng)戶造成了嚴重的損失。生物防治由于綠色無污染、持效期長等特點而被廣泛接受。李新宇等[15]測定枯草芽胞桿菌ZF161對番茄匍柄霉葉斑病盆栽防效達63.27%，本研究通過番茄離體葉片和活體盆栽試驗測定綠針假單胞菌YS05對番茄匍柄霉葉斑病防治效果分別達到71.52%和58.27%，其中離體葉片防效均高于對照藥劑，表明其具有良好的生防潛力。