王曉迪，冀順霞，申曉娜，劉萬(wàn)學(xué)，萬(wàn)方浩，張桂芬，呂志創(chuàng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)研究室，北京 100193）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)常見(jiàn)農(nóng)作物病蟲(chóng)害有 1700多種，且我國(guó)每年都有重大病蟲(chóng)害流行和暴發(fā)，其中常見(jiàn)農(nóng)作物病害有775種、害蟲(chóng)739種、雜草109種、鼠害42種，其具有分布范圍廣、成災(zāi)頻率高、突發(fā)性強(qiáng)等特點(diǎn)，隨之引發(fā)農(nóng)作物大面積減產(chǎn)，甚至絕收，同時(shí)病蟲(chóng)害也會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物品質(zhì)嚴(yán)重下降，尤其是外來(lái)生物入侵種更增加了對(duì)農(nóng)業(yè)的危害性[1-4]。2017年 8月在我國(guó)新疆伊犁地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)的番茄潛葉蛾Tuta absoluta具有非常強(qiáng)的快速傳播和適應(yīng)能力，現(xiàn)已在新疆、云南、貴州、四川、廣西、重慶、湖南、江西等8個(gè)省/直轄市/自治區(qū)的130多個(gè)縣（市、區(qū)）均有發(fā)生，發(fā)生面積逾10萬(wàn)畝次/年，潛在受害面積逾9700萬(wàn)畝，對(duì)番茄和馬鈴薯潛在直接經(jīng)濟(jì)損失逾370億元[5,6]。2018年12月草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda入侵我國(guó)[7]，目前已擴(kuò)散至我國(guó)西南、華南、江南、長(zhǎng)江中下游、黃淮、西北、華北地區(qū)的 26 ?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）的1518個(gè)縣（區(qū)、市）[8]，2019年草地貪夜蛾在我國(guó)的發(fā)生面積高達(dá)1500多萬(wàn)畝，玉米受害面積占比98%，直接經(jīng)濟(jì)損失約100億元[9-11]。由此可見(jiàn)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的危害力之大，危害范圍之廣，因此對(duì)其進(jìn)行有效防控十分必要。

目前的防治方法主要包括：農(nóng)業(yè)防治、生物防治、物理機(jī)械防治、化學(xué)防治等[12]。農(nóng)業(yè)防治技術(shù)基于合理的輪作、灌溉及科學(xué)的施肥等栽培技術(shù)和管理技術(shù)，雖可起到害蟲(chóng)防治的效果，但需精細(xì)化管理，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；生物防治技術(shù)基于天敵昆蟲(chóng)和致病微生物，采用“以蟲(chóng)治蟲(chóng)”的方式雖對(duì)環(huán)境無(wú)污染，但殺蟲(chóng)作用緩慢，且訓(xùn)化、繁殖天敵較難；物理防治技術(shù)基于燈光誘殺或溫度滅蟲(chóng)以及人工捕殺等方式，該方法操作簡(jiǎn)單、成本低，但防治效率及效果有限；化學(xué)防治技術(shù)基于一種或幾種化學(xué)藥劑起到防治害蟲(chóng)的效果，具有方便、見(jiàn)效快的優(yōu)點(diǎn)，但過(guò)度依賴或?yàn)E用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致有害蟲(chóng)的抗藥性顯著增強(qiáng)、農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染以及危害健康等一系列問(wèn)題[13-15]。因此，為對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)進(jìn)行有效防控，探索新的綠色、安全、高效的的害蟲(chóng)防治技術(shù)具有十分重要的意義。RNAi技術(shù)具有昆蟲(chóng)選擇性和基因特異性，通過(guò)對(duì)昆蟲(chóng)的基因研究，篩選出控制生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵靶基因，結(jié)合RNAi技術(shù)，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行沉默，從而達(dá)到有效防控害蟲(chóng)的目的。

1 RNAi在害蟲(chóng)防治中的潛力

RNAi（RNA interference）在2001年和2002年連續(xù)兩次被《Science》評(píng)為十大科學(xué)技術(shù)之一。RNAi能夠特異性地降低或關(guān)閉靶基因表達(dá)，不僅是基因功能研究的重要手段，也是至今為止最有可能應(yīng)用于害蟲(chóng)防治的生物工程技術(shù)[16]。1998 年，F(xiàn)ire等[17]在對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans的研究中，發(fā)現(xiàn)并定義了RNA干擾。 RNAi是指由雙鏈RNA（double-strand RNA，dsRNA）所誘發(fā)導(dǎo)致同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制[18]。其基本原理是：外源性的 dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后，被受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用吸收后[19,20]，首先由RNaseⅢ核酸酶家族的Dicer與dsRNA結(jié)合，隨后dsRNA被降解成19～21 bp長(zhǎng)度的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），然后siRNA與RNA沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合，再解旋成單鏈RNA，并由該復(fù)合體主導(dǎo)RNAi效應(yīng)。RISC被活化后，受siRNA引導(dǎo)，通過(guò)堿基配對(duì)特異性的結(jié)合在同源mRNA（靶標(biāo)）上切斷靶標(biāo)mRNA，引發(fā)靶標(biāo)mRNA的分解，從而產(chǎn)生靶標(biāo)基因的表達(dá)沉默[21,22]，作用過(guò)程如圖1所示[23]。

圖1 dsRNA的作用機(jī)制[23]Fig. 1 Mechanism of action of dsRNA[23]

昆蟲(chóng)主要包括外源性siRNA、內(nèi)源性siRNA和miRNA共3種RNAi途徑（圖2）[24]。研究表明抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要基因的表達(dá)，可以引起昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育障礙或者死亡，因此RNAi被認(rèn)為是一種有效的防控害蟲(chóng)的潛在方法，從而可避免化學(xué)殺蟲(chóng)劑的過(guò)度使用，利于促進(jìn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展[25-28]。昆蟲(chóng)攝入dsRNA是有巨大潛力進(jìn)行害蟲(chóng)治理的防控方法，其特點(diǎn)為：特異性高、抗蟲(chóng)精準(zhǔn)；操作簡(jiǎn)便、周期短，極大地節(jié)省人力和時(shí)間成本；安全，對(duì)非靶標(biāo)昆蟲(chóng)影響較小，RNA易降解，無(wú)殘留，是環(huán)境友好型的試劑；實(shí)用性高，dsRNA可被制備成用于噴霧或灌溉施用的制劑，大面積的施用于田間等[29,30]。

圖2 昆蟲(chóng)3種RNAi途徑示意圖[24]Fig. 2 Schematic diagram of 3 RNAi pathways in insects[24]

RNAi已在多種鱗翅目昆蟲(chóng)中成功應(yīng)用[31]。2002年首次報(bào)道了鱗翅目昆蟲(chóng)的RNAi方法，Bettencourt等[32]將dsRNA注入羅賓蛾Hyalophora cecropia蛹的血腔內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血紅素基因沉默導(dǎo)致胚胎死亡，并因此證明了血紅素在羅賓蛾胚胎發(fā)育過(guò)程中的重要作用。Quan等[33]將家蠶Bombyx mori白基因（white，Bmwh3）的dsRNA注入野生型家蠶的卵中，發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致Bmwh3位點(diǎn)基因沉默，并誘導(dǎo)出白卵和半透明膚色幼蟲(chóng)表型，表明Bmwh3dsRNA的作用導(dǎo)致了卵細(xì)胞中Bmwh3mRNA積累水平的降低，證明了注射dsRNA可用于昆蟲(chóng)的基因組功能分析。在斜紋夜蛾Spodoptera litura幼蟲(chóng)中注射氨肽酶（slapn）dsRNA，發(fā)現(xiàn)幼蟲(chóng)的apn的表達(dá)量減少，對(duì)于Cry1C毒素的敏感性相應(yīng)降低。通過(guò)將同源dsRNA導(dǎo)入斜紋夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)，抑制了斜紋夜蛾apn的表達(dá)，證明RNAi在整個(gè)幼蟲(chóng)體內(nèi)起作用[34]。Ellango等[35]檢測(cè)了小菜蛾P(guān)lutella xylostella酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因作為RNAi 靶基因的潛力。他們將dsRNA涂抹到卷心菜Brassica oleracea葉片上，讓小菜蛾幼蟲(chóng)取食，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幼蟲(chóng)取食dsRNA 3 d后死亡，與對(duì)照組相比死亡率顯著增高，且幼蟲(chóng)死亡率隨dsRNA濃度的增加而增加，最高可達(dá)90%。在干擾草地貪夜蛾細(xì)胞色素P450的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)飼喂dsRNA可誘導(dǎo)其2齡幼蟲(chóng)產(chǎn)生RNAi效應(yīng)，dsRNA對(duì)靶基因的沉默率為38.9%～54.3%，與對(duì)照組相比差異顯著[36]。以上研究結(jié)果表明，RNAi可成為防治不同鱗翅目害蟲(chóng)的潛在有力工具，在害蟲(chóng)管理實(shí)踐中具有廣闊的應(yīng)用前景。2015年，Camargo等[37]對(duì)番茄潛葉蛾的研究表明其體內(nèi)具有RNAi體系，且對(duì)RNAi具有較好的效應(yīng)。進(jìn)一步基于轉(zhuǎn)錄組信息篩選5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期高表達(dá)的靶基因，體外合成dsRNA，并將番茄葉片浸泡于含有靶基因dsRNA的溶液中，然后用于飼喂1齡幼蟲(chóng)，檢測(cè)結(jié)果表明，飼喂dsRNA后，5個(gè)靶基因均導(dǎo)致幼蟲(chóng)體質(zhì)量顯著下降。Camargo等[38]在2016年通過(guò)浸泡和PITGS（Plant-induced Transient Insect Gene Silencing）兩種方法將dsRNA導(dǎo)入到番茄葉片中，讓番茄潛葉蛾幼蟲(chóng)取食含有V-ATPase（Vacuolar ATPase-A）和AK（Arginine kinase）靶基因的dsRNA的葉片，72 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累量分別降低了35% 和40%，24 d后平均死亡率分別達(dá)到50%和43%，葉片的損傷率降低，由此可見(jiàn)RNAi作為一種控制番茄害蟲(chóng)的替代方法是可行的。2019年，Majidiani等[39]通過(guò)注射和根傳遞dsRNA的方法，對(duì)在番茄潛葉蛾神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用的3個(gè)基因——RyRs（ryanodine receptors）、AChE（acetylcholinesterase subunit 1）和nAChRs（nicotinic acetylcholine receptor α6）進(jìn)行了RNA干擾，試驗(yàn)結(jié)果顯示注射dsRNA能夠顯著降低靶基因的表達(dá)量，注射2 μg和5 μg dsRNA可使基因表達(dá)降低62.7%～75.4% ，最大死亡率為92.59%；根系吸收5 μg dsRNA后靶基因表達(dá)量降到47%～69%，其死亡率可達(dá)到67.1%～80.5%。RNAi在番茄潛葉蛾上的成功應(yīng)用，為今后利用dsRNA防治該害蟲(chóng)提供了保障。

RNAi也被廣泛的應(yīng)用于其他昆蟲(chóng)。例如，2012年，dsRNA干擾首次在鞘翅目昆蟲(chóng)玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgiferaLeConte中應(yīng)用[40]，通過(guò)飼喂DvSnf7 dsRNA，5 d后DvSnf7 蛋白水平顯著降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)dsRNA效率與靶基因序列的特異性、濃度以及時(shí)間等密切相關(guān)[41]。最近的研究表明，通過(guò)RNAi 可降低與灰飛虱Laodelphax striatellus節(jié)律行為相關(guān)的tim（timeless）基因的表達(dá)，并導(dǎo)致灰飛虱成蟲(chóng)晝夜節(jié)律紊亂[42]。Santos-Ortega和Killiny[43]對(duì)柑橘木虱Diaphorinacitri蔗糖水解酶同系物基因DcSuh進(jìn)行了鑒定并通過(guò)RNAi 技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行分析。他們分別將不同劑量的DcSuh-dsRNA注射到木虱體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 ng 的dsRNA 就能引起木虱幼蟲(chóng)死亡，在dsRNA 處理后的幼蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)到蔗糖水解酶活性降低，而成蟲(chóng)則出現(xiàn)了腹水癥的現(xiàn)象。

以上研究結(jié)果均表明，抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要基因的表達(dá)，可以引起昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育障礙或者死亡，說(shuō)明RNAi 作為新型防治技術(shù)應(yīng)用于害蟲(chóng)防治具有巨大潛力。相較于其他昆蟲(chóng)，目前存在的問(wèn)題是，RNAi在鱗翅目昆蟲(chóng)中應(yīng)用效率較低，其主要原因是dsRNA被細(xì)胞吸收的效率較低[44]，因?yàn)閐sRNA在鱗翅目昆蟲(chóng)體內(nèi)被降解的速率顯著高于其他昆蟲(chóng)如鞘翅目昆蟲(chóng)[45]。大部分 dsRNA進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)后會(huì)首先被血淋巴或中腸中存在的核酸酶降解，使其不能進(jìn)入RNAi途徑發(fā)揮沉默靶標(biāo)基因的功能，因此如何解決這類核酸酶的降解作用是提高RNAi效率的關(guān)鍵[46-50]。

2 RNAi在昆蟲(chóng)中的研究狀況

為達(dá)到有效利用RNAi技術(shù)防控害蟲(chóng)的目的，提高RNAi的效率是首要前提。首先要篩選有效的靶基因，因?yàn)椴煌虻腞NAi效率差別顯著；同時(shí)需要提高dsRNA在昆蟲(chóng)體內(nèi)的穩(wěn)定性，從而達(dá)到沉默靶基因的效果。

2.1 昆蟲(chóng)關(guān)鍵功能基因解析

深度解析調(diào)控昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖和行為等方面的關(guān)鍵基因，充分利用害蟲(chóng)特有的基因和特異性基因序列，是利用RNAi 進(jìn)行害蟲(chóng)防治策略成功的關(guān)鍵。昆蟲(chóng)關(guān)鍵功能基因一般分為以下幾種：干擾保幼激素或蛻皮激素相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致幼蟲(chóng)不能正常發(fā)育提前進(jìn)入蛹期或直接導(dǎo)致死亡[51,52]，如干擾保幼激素受體（Met和Gce等）和轉(zhuǎn)錄因子基因（Kr-h1），可導(dǎo)致幼蟲(chóng)提前蛹化或直接死亡[53-58]；干擾蛻皮激素相關(guān)信號(hào)通路，抑制昆蟲(chóng)的正?；己陀鸹?，如干擾幾丁質(zhì)合成，促使昆蟲(chóng)發(fā)育不良，不能正常蛻皮甚至死亡[59-61]，干擾蛻皮激素受體基因（如EcR和USP等）和轉(zhuǎn)錄因子（如Br）也會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)產(chǎn)生蛻皮缺陷而死亡[62,63]；擾亂生殖和產(chǎn)卵相關(guān)信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)控制害蟲(chóng)種群數(shù)量，如干擾羥基-3-甲基戊二酰輔酶A[64]、卵黃原蛋白受體[65]、表皮蛋白基因[66]、ATP水解酶基因[67]、親環(huán)蛋白B基因[68]；擾亂昆蟲(chóng)免疫和抗性機(jī)制，如對(duì)農(nóng)藥抗性、沉默解毒代謝和免疫相關(guān)基因等干擾，降低害蟲(chóng)對(duì)靶標(biāo)農(nóng)藥的抗性，常見(jiàn)的基因有小G 蛋白R(shí)as基因[69]、細(xì)胞色素 P450CYP6AE14、CYP6BG1、CYP321A8、CYP321B1和CYP6AE44基因[70-73]。

保幼激素（Juvenile hormones，JHs）是昆蟲(chóng)咽側(cè)體（corpora allata，CA）合成并分泌的一種倍半萜烯類物質(zhì)，在昆蟲(chóng)體內(nèi)不僅調(diào)控幼蟲(chóng)生長(zhǎng)特性、促進(jìn)卵巢成熟、阻礙幼蟲(chóng)過(guò)早的進(jìn)入下一齡期[74]，而且參與昆蟲(chóng)體型外觀、蛻皮、滯育、刺激雌性成蟲(chóng)體內(nèi)卵黃形成等生理生化過(guò)程[75]。蛻皮激素（Ecdysone，Ecd）是由昆蟲(chóng)的前胸腺合成并分泌的一種類固醇激素，對(duì)調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝和生殖等具有重要作用[76-78]。保幼激素和蛻皮激素協(xié)同調(diào)控昆蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育[79]，幼蟲(chóng)期高滴度JH確保高滴度20E（20-hydroxyecdysone）只觸發(fā)幼蟲(chóng)間的蛻皮，但是末齡幼蟲(chóng)，JH 滴度下降，同時(shí)，高滴度20E 觸發(fā)幼蟲(chóng)-蛹或幼蟲(chóng)-成蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育[51,63,80-84]。保幼激素和蛻皮激素在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必不可少，因此，干擾這兩類物質(zhì)使其不能正常發(fā)揮作用，是利用RNA干擾防治害蟲(chóng)的最有效途徑之一。

Methoprene是保幼激素的類似物，1986年，Wilson等[85]首次報(bào)道了Met（methoprene-tolerant）突變體果蠅對(duì)JH抗性研究，發(fā)現(xiàn)過(guò)量的JH處理可以誘導(dǎo)果蠅幼蟲(chóng)生成假瘤（pseudotumor），而Met突變體對(duì)這種誘導(dǎo)作用的耐受能力遠(yuǎn)強(qiáng)于正常果蠅。2013年Jindra等[82]確定了Met轉(zhuǎn)錄因子是JH的核內(nèi)受體，提示保幼激素主要在細(xì)胞核中作用于基因的表達(dá)和功能，使得 JH的分子機(jī)制被慢慢揭開(kāi)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Met有一個(gè)旁系同源基因Gce（Germ cell-expressed）[86]，Gce也是一種bHLH-PAS（basic helix-loop-helix Per-AhR/Arnt-Sim）蛋白，能夠結(jié)合JH[87-89]。昆蟲(chóng)咽側(cè)體（CA）合成并分泌JH，在血淋巴中形成JH-JHBP聚合物，隨著體液循環(huán)，JH-JHBP識(shí)別結(jié)合靶細(xì)胞，之后JH脫離JHBP進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與Met結(jié)合激活下游信號(hào)[90]。果蠅中存在Gce，當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)JH濃度較低時(shí)，Met聚合為同源二聚體Met-Met 或者異源二聚體Met-Gce，當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)JH 濃度較高時(shí)，JH與Met 結(jié)合，導(dǎo)致Met-Met/Met-Gce解離[88,91,92]，隨后Met結(jié)合SRC（steroid receptor coactivator）或FISC（βFtz-F1 interacting steroid receptor coactivator）等形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體Met/SRC或Met/FISC 結(jié)合到下游基因JH反應(yīng)元件JHRR（位于Kr-h1 啟動(dòng)子區(qū)域，包含3個(gè)E-box-like序列）區(qū)域，調(diào)控Kr-h1（Krüppel-homolog1）的表達(dá)[84,93-95]，保幼激素級(jí)聯(lián)調(diào)控的模式如圖 3[96]。Kr-h1作為JH 信號(hào)通路中下游關(guān)鍵應(yīng)答基因，編碼含有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)控JH的合成。Kr-h1通過(guò)受體Met和Gce傳遞保幼激素信號(hào)，維持幼蟲(chóng)狀態(tài)，調(diào)控幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育與變態(tài)，通過(guò)注射dsRNA降低梨小食心蟲(chóng)Grapholita molesta GmMet和GmKr-h1的表達(dá)，結(jié)果出現(xiàn)幼蟲(chóng)的存活率顯著降低、蛹畸形以及存活成蟲(chóng)的繁殖力降低的現(xiàn)象[56]。GmMet和GmKr-h1的氨基酸序列與其他鱗翅目昆蟲(chóng)，特別是棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigeraHübner具有高度同源性，同時(shí)JH在發(fā)育、變態(tài)和繁殖中的功能在完全變態(tài)和不完全變態(tài)的昆蟲(chóng)中的進(jìn)化中都是保守的，因此JH信號(hào)通路為害蟲(chóng)dsRNA防控提供了合適的靶標(biāo)位點(diǎn)[56,82]。Tai（Taiman）也是bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，Met/Tai異源二聚體介導(dǎo)JH信號(hào)，觸發(fā)Kr-h1，調(diào)節(jié)幼蟲(chóng)發(fā)育，防止早熟[97]。對(duì)德國(guó)小蠊Blattella germanica[98]和始紅蝽Pyrrhocoris apterus[99]中的Tai進(jìn)行RNAi，結(jié)果導(dǎo)致幼蟲(chóng)100%的死亡率。在赤擬谷盜Tribolium castaneum[100]和果蠅Drosophila melanogaster[92]的試驗(yàn)中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。在馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsa decemlineata三齡幼蟲(chóng)體內(nèi)連續(xù)注射Tai-dsRNA可導(dǎo)致約20%的幼蟲(chóng)死亡率和80%的化蛹失敗率，因此Tai在JH通路中發(fā)揮重要作用，也是一個(gè)潛在的RNAi基因[101,102]。

圖3 保幼激素級(jí)聯(lián)調(diào)控[96]Fig. 3 Juvenile hormone cascade regulation diagram[96]

2.2 基于納米載體的RNAi應(yīng)用

傳統(tǒng)的 dsRNA遞送技術(shù)包括顯微注射、轉(zhuǎn)基因植物、飼喂或浸泡。顯微注射可以避免表皮或腸道上皮的屏障作用，將dsRNA精確地遞送到靶細(xì)胞處，通過(guò)注射方法在番茄潛葉蛾中驗(yàn)證了潛在的RNAi的靶基因[39]，但是此方法僅適用于RNAi靶基因的功能分析，卻不能在田間進(jìn)行推廣應(yīng)用。植物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物，如轉(zhuǎn)基因玉米，在害蟲(chóng)防控方面取得了突破性進(jìn)展，但是需要在多種谷物中開(kāi)發(fā)葉綠體轉(zhuǎn)化協(xié)議，擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因技術(shù)的作物范圍，且大多數(shù)國(guó)家仍將轉(zhuǎn)基因作物視為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，由于其潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，需要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)估[28]。與植物介導(dǎo)的dsRNA傳遞相比，非轉(zhuǎn)化傳遞策略因其時(shí)間短、開(kāi)發(fā)成本低、抗性風(fēng)險(xiǎn)低、調(diào)控過(guò)程簡(jiǎn)單、對(duì)所有作物都具有可行性而受到青睞[103]。

dsRNA在體內(nèi)表皮的穿透能力和穩(wěn)定性有限，因此需要進(jìn)一步提高其穿透效率和穩(wěn)定性，進(jìn)而提高對(duì)靶標(biāo)的干擾效率，以滿足害蟲(chóng)防治的實(shí)際需要。目前在提高 dsRNA穩(wěn)定性方面的研究主要集中在脂質(zhì)體或納米粒子對(duì) dsRNA進(jìn)行包裹以保護(hù)其不被消化系統(tǒng)內(nèi)的各種酶降解[28,104,105]。納米顆粒介導(dǎo)的 dsRNA遞送系統(tǒng)在提高RNAi效率方面具有突出的優(yōu)勢(shì)[28,106-109]。在大多數(shù)情況下，納米顆粒的陽(yáng)離子基團(tuán)可通過(guò)靜電相互作用與dsRNA的磷酸基團(tuán)結(jié)合形成dsRNA/納米顆粒復(fù)合物[110,111]。陽(yáng)離子核殼型熒光納米顆粒（cationic core-shell fluorescent nanoparticles，F(xiàn)NP）、支化兩親肽膠囊——BAPCs（Branched Amphiphilic Peptide Capsules）和殼聚糖（chitosan，CS）等已成功應(yīng)用于生物工程dsRNA研究領(lǐng)域[28]。其中殼聚糖是一種天然的高分子材料，來(lái)源于海洋生物[112]，具有良好的安全性、生物相容性和生物可降解性等特點(diǎn)，CS 分子中帶正電荷的葡糖胺基可與帶負(fù)電荷的DNA、dsRNA等產(chǎn)生靜電作用，形成較為穩(wěn)定的多聚復(fù)合物，它作為一種極有前途的 dsRNA、siRNA、質(zhì)粒 DNA、寡核苷酸、多肽甚至蛋白質(zhì)的遞送系統(tǒng)而受到人們的關(guān)注[113-118]。

近十幾年來(lái)，納米技術(shù)迅速發(fā)展，并且廣泛滲透于各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，形成了一系列既相對(duì)獨(dú)立又互相聯(lián)系的分支學(xué)科。納米材料是指在三維空間中，至少有一維處于納米尺度范圍（1～100 nm）或者由它們作為基本單元所構(gòu)成的材料，尺度大概相當(dāng)于 10～100個(gè)原子緊密地排列在一起[119]。納米材料由于較小的尺寸，較大的比表面積，優(yōu)異的光學(xué)、力學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)及化學(xué)反應(yīng)性能，使其應(yīng)用研究正在半導(dǎo)體芯片、癌癥診斷、光學(xué)新材料和生物分子追蹤等領(lǐng)域高速發(fā)展[120,121]，被譽(yù)為21世紀(jì)最有前途的材料，并在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[122]。納米顆粒載導(dǎo)的dsRNA/siRNA的傳遞過(guò)程主要包括納米顆粒與核酸的結(jié)合或納米顆粒將核酸包裹、細(xì)胞的攝取、內(nèi)涵體逃逸、以及核酸釋放或納米復(fù)合物的降解四個(gè)步驟。其具體過(guò)程為納米顆粒的陽(yáng)離子基團(tuán)可以通過(guò)靜電相互作用與dsRNA的磷酸基團(tuán)結(jié)合形成dsRNA/納米顆粒復(fù)合物，當(dāng)昆蟲(chóng)攝入后，dsRNA/納米顆粒復(fù)合物先與細(xì)胞膜結(jié)合，然后通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞攝取復(fù)合物后，會(huì)形成一個(gè)包含復(fù)合物的小泡，該小泡沿著微管移動(dòng)到達(dá)內(nèi)涵體，陽(yáng)離子聚合物能夠保護(hù)dsRNA/siRNA，避免其被核酸酶降解，最終dsRNA/siRNA從內(nèi)涵體中釋放出來(lái)并在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，如圖3所示[28]。

納米顆粒介導(dǎo)的RNAi在許多昆蟲(chóng)中得到了成功應(yīng)用[28]。2013年，He等[107]報(bào)道了一種陽(yáng)離子核殼型熒光納米顆粒（cationic core-shell fluorescent nanoparticle (FNP)），他們以亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis為研究對(duì)象，讓幼蟲(chóng)取食含有FNP/CHT10-dsRNA混合物的飼料，進(jìn)而成功抑制幾丁質(zhì)酶基因CHT10的表達(dá)，該結(jié)果表明FNP可作為一種高效的基因載體，能成功載導(dǎo)dsRNA抑制關(guān)鍵靶基因的表達(dá)，阻礙幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而起到防控害蟲(chóng)的效果。這是首例通過(guò)納米熒光顆粒載導(dǎo)dsRNA應(yīng)用于害蟲(chóng)的研究。自此后，納米載體載導(dǎo) dsRNA在不同的害蟲(chóng)中均有成功應(yīng)用的報(bào)道。Zhang等[115]的研究表明，幼蟲(chóng)攝取了chitosan/interfering RNA納米顆粒與食物結(jié)合的混合物后，成功地抑制岡比亞按蚊Anopheles gambiae和埃及伊蚊Aedes aegypti幼蟲(chóng)的多個(gè)基因表達(dá)，進(jìn)一步qRT-PCR或原位雜交證明，喂養(yǎng)幼蟲(chóng)后，對(duì)相關(guān)基因的抑制至少可以持續(xù)到蛹晚期。此試驗(yàn)驗(yàn)證了殼聚糖納米顆粒可用于dsRNA及siRNA的遞送的有效性，殼聚糖因其成本低、無(wú)毒、可生物降解等優(yōu)勢(shì)，可以作為害蟲(chóng)防治的優(yōu)質(zhì)材料，擁有廣闊的應(yīng)用前景。德國(guó)小蠊對(duì)dsRNA的注射高度敏感，通過(guò)RNAi可有效抑制相關(guān)基因的表達(dá)，因此充分利用這一特征可對(duì)其進(jìn)行有效防控，通過(guò)脂質(zhì)體包裹dsRNA以延緩其在中腸內(nèi)的降解，試驗(yàn)結(jié)果顯示飼喂脂質(zhì)體包裹的dsRNA后，德國(guó)小蠊α-tubulin基因的表達(dá)被抑制，導(dǎo)致死亡[123,124]。Avila等[125]運(yùn)用一種全肽納米材料——BAPCs（Branched Amphiphilic Peptide Capsules）結(jié)合dsRNA飼喂豌豆蚜Acyrthosiphon pisum和赤擬谷盜Tribolium castaneum，與攝入相同量的BiP-dsRNA相比，食用BiP-dsRNA與BAPCs復(fù)合物可導(dǎo)致豌豆蚜幼蟲(chóng)過(guò)早的死亡；采用BiP-dsRNA和Armet-dsRNA與BAPCs復(fù)合物可有效殺死赤擬谷盜，大多數(shù)（約75%）在幼蟲(chóng)期或羽化期死亡，單獨(dú)喂養(yǎng)dsRNA死亡率較低（約30%）。此結(jié)果顯示通過(guò)與納米材料的有效結(jié)合，可以提高dsRNA的干擾效率。Parsons等[108]在草地貪夜蛾中測(cè)試了一種合成的鳥(niǎo)苷酸聚合物（poly-[N-(3-guanidinopropyl) methacrylamide]，(pGPMA)），發(fā)現(xiàn) Polymer-dsRNA interpolyelectrolyte complexes（IPECs）能夠有效地被細(xì)胞吸收，觸發(fā)RNAi，并驅(qū)動(dòng)高效的基因抑制，抑制效率可達(dá)80%，進(jìn)而致使昆蟲(chóng)的死亡率達(dá)35%。Christiaens等[126]使用鳥(niǎo)苷酸聚合物作為載體可防止dsRNA被鱗翅目昆蟲(chóng)堿性腸溶液降解，飼喂甜菜夜蛾Spodoptera exigua納米顆粒dsRNA復(fù)合物后，可有效干擾幾丁質(zhì)合成酶B（chitin synthase B，ChSB）基因，使得該害蟲(chóng)的死亡率從16%提升到了53% 。Zheng等[127]在大豆蚜Aphis glycines上建立了一種納米材料介導(dǎo)的dsRNA體壁滲透系統(tǒng)，在大豆蚜體壁上噴灑該復(fù)合物獲得了95.4%的RNAi效率和80.5%的種群抑制效應(yīng)。Yan等[128]在前期研究的基礎(chǔ)上以星形陽(yáng)離子聚合物為載體，通過(guò)局部施用和噴灑的方式使得dsRNA有效穿過(guò)大豆蚜Aphis glycines的體壁，其死亡率分別達(dá)到了81.67%和78.5%。以上成功的試驗(yàn)案例可以看出RNAi作為重要的研究工具通過(guò)與納米載體結(jié)合為害蟲(chóng)防治提供了新的前景，尤其在鱗翅目昆蟲(chóng)中可通過(guò)納米載體提高干擾效率。基于Yan等[28]的綜述，對(duì)近幾年來(lái)納米粒子介導(dǎo)的RNAi技術(shù)在重要害蟲(chóng)中的研究及應(yīng)用進(jìn)行了補(bǔ)充和總結(jié)，詳見(jiàn)表1。

表1 納米粒子介導(dǎo)的 RNA干擾（RNAi）在昆蟲(chóng)中的成功應(yīng)用Table 1 Successful applications of nanoparticle-mediated RNA interference (RNAi) in insects

圖4 納米顆粒介導(dǎo)的雙鏈RNA/小分子RNA（dsRNA/siRNA）傳遞系統(tǒng)示意圖[28]Fig. 4 Schematic representation of nanoparticle-mediated double-stranded RNA/small interfering RNA (dsRNA/siRNA) delivery system[28]

3 基于工程菌高效合成靶向昆蟲(chóng)的dsRNA

利用RNAi技術(shù)在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防控方面研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但目前RNAi技術(shù)在田間應(yīng)用的主要限制因素是 dsRNA的合成成本過(guò)高，因此不利于產(chǎn)品的推廣。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)沈杰教授的研究團(tuán)隊(duì)利用L4440 質(zhì)粒和大腸桿菌HT115(DE3)菌株，建立了一種經(jīng)濟(jì)、高效的昆蟲(chóng)靶標(biāo)基因dsRNA合成方法。該團(tuán)隊(duì)以異色瓢蟲(chóng)Harmonia axyridis(Pallas)vestigial為試驗(yàn)對(duì)象通過(guò)構(gòu)建有目的基因片段的RNAi載體，利用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌HT115（DE3）表達(dá)合成vg-dsRNA，vg-L4440 重組表達(dá)載體的構(gòu)建以及vg-dsRNA誘導(dǎo)過(guò)程如圖5所示，與商業(yè)化的dsRNA合成試劑盒相比，工程菌合成dsRNA的方法大幅降低了dsRNA 的合成成本[145]。通過(guò)將dsRNA與納米載體結(jié)合，保護(hù)其進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)不被核酸酶降解，從而產(chǎn)生RNAi，以達(dá)到綠色、安全、高效的害蟲(chóng)防控目標(biāo)。最近該團(tuán)隊(duì)通過(guò)去除大腸桿菌BL21（DE3）中的編碼核糖核酸內(nèi)切酶RNase III的rnc基因，并與含有單一T7啟動(dòng)子的RNAi表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建了一種新型的pET28-BL2（DE3）RNase III系統(tǒng)，其表達(dá)效率是L4440-HT115（DE3）的3倍，該系統(tǒng)為大規(guī)模生產(chǎn)dsRNA提供了一種低成本、高效率的新方法，將會(huì)更好地促進(jìn)基因功能分析以及基于RNAi害蟲(chóng)防治的發(fā)展[146]。

圖5 Vg-L4440 重組表達(dá)載體的構(gòu)建以及vg-dsRNA 誘導(dǎo)過(guò)程[145]Fig. 5 Construction of Vg-L4440 recombinant expression vector and vg-dsRNA induction process

4 展望

每年害蟲(chóng)擴(kuò)散和暴發(fā)引起的農(nóng)作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失巨大，因此對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防控不容忽視，同時(shí)，抗藥性、殘留、污染等問(wèn)題備受關(guān)注，因此需選擇綠色、安全、高效的防控措施進(jìn)行防控。RNAi是近幾年來(lái)迅速發(fā)展的一項(xiàng)抑制基因表達(dá)的技術(shù)，在基因治療和害蟲(chóng)的遺傳學(xué)控制方面表現(xiàn)出了很好的應(yīng)用潛能，同時(shí)也是一種潛在的防治害蟲(chóng)的工具，而利用RNAi進(jìn)行有效的害蟲(chóng)防治的最大挑戰(zhàn)是開(kāi)發(fā)高效可靠的dsRNA生產(chǎn)和遞送技術(shù)。以納米粒子為載體，可有效防止dsRNA在昆蟲(chóng)體內(nèi)被核酸酶降解，保護(hù) dsRNA安全到達(dá)靶標(biāo)位點(diǎn)后有效釋放并發(fā)揮 RNAi作用，同時(shí)工程菌高效合成靶向昆蟲(chóng)dsRNA的方法，降低了dsRNA的合成成本，為dsRNA的大量合成提供了技術(shù)支撐，推動(dòng)了RNAi核心技術(shù)在害蟲(chóng)防治方面的新發(fā)展，最終可通過(guò)葉面噴灑、根灌、樹(shù)干注射等[147]多種方式進(jìn)行推廣應(yīng)用，充分發(fā)揮RNA干擾的效應(yīng)。本文對(duì)采用納米載導(dǎo)dsRNA技術(shù)進(jìn)行害蟲(chóng)防控的相關(guān)研究及應(yīng)用進(jìn)行了綜述，以期為害蟲(chóng)防控提供新的思路，達(dá)到有效的防控效果，減少害蟲(chóng)暴發(fā)造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，保證農(nóng)作物的安全生產(chǎn)。