董 琪, 李 娜, 劉 露, 胡萬(wàn)祥， 鮑 偉， 王夢(mèng)雪， 杜偉健

(1.亳州學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；2. 藥食同源功能食品亳州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 亳州 236800)

黃精在我國(guó)已有兩千余年藥用歷史,是一種藥食同源的植物,黃精植物資源豐富,品種繁多,具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。藥理實(shí)驗(yàn)表明黃精具有降血壓、降血糖、抗菌、抗衰老等作用。黃精中含量最多的主要成分是糖類(lèi),經(jīng)鑒定這些糖類(lèi)主要包括多糖、低聚糖和單糖等,其中黃精多糖是黃精中重要的活性成分之一。

目前,針對(duì)黃精多糖的研究主要集中在不同地域、品種、生長(zhǎng)年齡、部位等黃精多糖含量的測(cè)定,藥理作用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究以及多糖提取、純化工藝的優(yōu)化和抗氧化活性研究。多糖提取的方法較多,常用的方法有水浸提法、醇析分離法、酸堿提取法、微波輔助和超聲波輔助提取等。黃精多糖提取率的高低與黃精品種、質(zhì)量、產(chǎn)地和提取方法等有較大關(guān)系,與傳統(tǒng)熱水提取方法相比,超聲輔助提取法可一定程度節(jié)省提取時(shí)間,簡(jiǎn)化提取流程,提高黃精多糖提取率。因此,本研究結(jié)合超聲波輔助法,分別采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)黃精多糖提取取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,以維生素 C 作為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)黃精多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究,為黃精多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精,產(chǎn)自安徽霍山,購(gòu)于亳州康美中藥材交易市場(chǎng)。葡萄糖、苯酚、濃硫酸購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;DPPH(Sigma公司);HO(Aladdin公司);FeSO、鄰苯三酚、無(wú)水乙醇、乙醚、氫氧化鈉、Tris-HCl緩沖液購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純。

UV-752 型紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器廠);UC-250DE超聲波清洗器(上海精其儀器有限公司);高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津索斯特儀器有限公司);ME204E電子分析天平(梅特勒);GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊);L600高速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);HH-3A單列單控三孔水浴鍋(常州國(guó)宇儀器制造有限公司);WB400US數(shù)控超聲波清洗器(上海王標(biāo)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

黃精→篩選→清洗→低溫干燥→粉碎→黃精粉末→過(guò)篩→脫脂→保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 以葡萄糖為標(biāo)樣,采用硫酸-苯酚比色法測(cè)定黃精多糖,參照蔡興航等的方法。精確稱(chēng)取在105 ℃烘至恒重的葡萄糖樣品25 mg,定容至250 mL。分別取梯度體積的葡萄糖溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、0.10 mL)于具塞試管中,依次分別加入適量蒸餾水至2 mL,隨后加入5%苯酚1 mL和3 mL濃硫酸,震蕩,反應(yīng)30 min。每樣平行3次。在紫外可見(jiàn)分光分光度計(jì)490 nm處測(cè)吸光度值。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X),以吸光度值為縱坐標(biāo)(Y),繪圖,結(jié)果如圖1所示。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為 y=1.134 4x+0.010 5,

R

=0.997 9,線性關(guān)系良好,可用于黃精多糖的測(cè)定。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2.2 黃精多糖提取流程 稱(chēng)取黃精樣品5 g于燒杯中,加入一定比例的蒸餾水,放置在超聲波清洗器中,調(diào)節(jié)相應(yīng)溫度,提取一定時(shí)間,將提取液過(guò)濾,轉(zhuǎn)移至容量瓶中,定容備用。用苯酚-硫酸法測(cè)定吸光度,結(jié)合葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算多糖得率。

1.2.3 黃精多糖提取優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.3.1 單因素試驗(yàn) 超聲功率對(duì)黃精多糖提取率的影響:為得到最佳的超聲功率,最大程度的獲得黃精多糖,準(zhǔn)確稱(chēng)取黃精多糖5 g,料液比(g/mL)為1∶25,超聲波時(shí)間為60 min,提取溫度為65 ℃,考察超聲波功率為120、150、180、210 W條件下黃精多糖的提取率。

超聲提取溫度對(duì)黃精多糖提取率的影響:為得到最佳的超聲提取溫度,最大程度的獲得黃精多糖,準(zhǔn)確稱(chēng)取黃精多糖5 g,超聲功率由以上單因素實(shí)驗(yàn)獲得,超聲提取時(shí)間為60 min,料液比(g/mL)為1∶25,考察超聲提取溫度為50、60、70、80、90 ℃對(duì)黃精多糖提取率的影響。

料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響:為得到最佳的料液比,最大程度的獲得黃精多糖,準(zhǔn)確稱(chēng)取黃精多糖5 g,超聲功率和超聲提取功率由以上單因素確定,超聲提取時(shí)間為60 min,考察料液比(g/mL)為1∶10、1∶15 、1∶20、1∶25、1∶30對(duì)黃精多糖提取率的影響。

超聲提取時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率的影響:為得到最佳的超聲提取時(shí)間,最大程度的獲得黃精多糖,準(zhǔn)確稱(chēng)取黃精多糖5 g,超聲功率、超聲提取時(shí)間和料液比由以上單因素實(shí)驗(yàn)獲得,考察超聲提取時(shí)間為20、40、60、80、100 min對(duì)黃精多糖提取率的影響。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取超聲功率、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間、料液比4個(gè)因素,每個(gè)因素取3個(gè)水平,以黃精多糖提取率作為考察指標(biāo),進(jìn)行L(3)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1),得到最佳提取條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表L9(34)

1.2.4 黃精多糖的抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1 黃精多糖對(duì)DPPH·清除效果的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7]中DPPH·法測(cè)定抗氧化能力,略有修改。用無(wú)水乙醇配制0.15 mg/mL 的DPPH·溶液,冷暗處保存?zhèn)溆?。取不同濃度的樣品溶? mL,加入 DPPH·溶液1.5 mL,用無(wú)水乙醇定容到10 mL,冷暗處?kù)o置30 min,在517 nm 處的吸光度為A;以無(wú)水乙醇取代樣品,同法測(cè)得的吸光度為A; 取不同樣品溶液1 mL,用無(wú)水乙醇定容到10 mL,測(cè)定的吸光度為A。以相同濃度的維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照,按式(1) 計(jì)算黃精多糖對(duì)DPPH·的清除率。

清除率(%)=(

A

-

A

+

A

)

/A

×100

(1)

1.2.4.2 黃精多糖對(duì)·OH的清除效果的測(cè)定 ·OH 的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[7]。在比色管中依次加入9.0 mmol/L的 FeSO溶液1.0 mL、9.0 mmol/L的水楊酸溶液1.0 mL和1.0 mL多糖溶液,混合后充分搖勻,再加入8.8 mmol/L 的HO溶液1.0 mL,37 ℃水浴鍋下反應(yīng)30 min,于510 nm處測(cè)定吸光度A。不加樣液所測(cè)的吸光度為A,不加HO溶液所測(cè)的吸光度為A。通過(guò)公式(1)計(jì)算清除率并以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲波功率對(duì)黃精多糖提取率的影響 由圖2可知,黃精多糖提取率隨超聲波功率的増大而逐漸提高,在超聲波功率150 W時(shí)達(dá)到最大,之后,隨著超聲功率的增加,提取率略有下降。次現(xiàn)象可能因?yàn)楣β试黾蛹涌炝嗣附閷?dǎo)的反應(yīng),但功率過(guò)大會(huì)對(duì)酶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞,且造成黃精多糖降解。由此選取最佳的超聲波功率為150 W。

圖2 超聲波功率對(duì)黃精多糖提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)黃精多糖提取率的影響 由圖3可知,隨著提取溫度不斷升高,黃精多糖提取率增大,在60 ℃達(dá)到最大值,當(dāng)溫度不斷上升時(shí),多糖提取率又呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。此現(xiàn)象與多糖穩(wěn)定性有關(guān),隨著溫度升高,可能引起部分黃精多糖的分解及結(jié)構(gòu)的破壞,一定程度影響其生物活性。由此選取最佳的提取溫度為60 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)黃精多糖提取率的影響

2.1.3 料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響 由圖4可知,黃精多糖提取率隨物料與溶液的比例的増大而升高,但當(dāng)料液比大于1∶15時(shí),多糖提取率變化不大。這與涂宗財(cái)?shù)壤贸暡ㄌ崛『扇~多糖和劉姝霖利用超聲波提取月見(jiàn)草葉多糖料液比結(jié)果類(lèi)似。由此選取最佳的料液比為1∶15 g/mL。

圖4 料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率的影響 黃精多糖的提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,但提取時(shí)間達(dá)到60 min后,提取時(shí)間再增加提取率略有下降。這與在40～60 min,樣品中的多糖逐漸從細(xì)胞中溶出,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸達(dá)到平衡,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)就會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)造成破壞,導(dǎo)致提取率下降。由此選取最佳的提取時(shí)間為60 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

黃精多糖提取率正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。根據(jù)極差分析,4個(gè)參數(shù)對(duì)黃精多糖提取率的影響主效應(yīng)為料液比>提取時(shí)間>提取溫度>超聲功率,最優(yōu)組合為ABCD,即功率為180 W,溫度為60 ℃,時(shí)間為70 min,料液比為1∶15 g/mL。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),提取率為10.48%±0.27%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果L9(34)

2.3 黃精多糖的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 黃精多糖對(duì)DPPH·的清除率 從圖5可以看出，隨著黃精多糖溶液濃度的增大，其對(duì)DPPH·的清除率越來(lái)越高，但相較于維生素C對(duì)DPPH·的清除能力要小，黃精多糖清除DPPH·的IC50值為13.71 mg/mL。

圖5 黃精多糖清除DPPH·的能力

2.3.2 黃精多糖對(duì)·OH 的清除率 從圖6可以看出，隨著黃精多糖溶液濃度的增大，其對(duì)·OH的清除率越來(lái)越高，但相較于維生素C對(duì)·OH的清除能力要小，黃精多糖清除·OH的IC50值為10.79 mg/mL。

圖6 黃精多糖清除·OH的能力

圖7 黃精多糖清除的能力

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),借助超聲波輔助提取黃精多糖,得到最佳工藝條件為:超聲波功率180 W,提取溫度60 ℃,超聲波時(shí)間70 min,料液比1∶15(g/mL)時(shí),黃精多糖的提取率為10.48%。