楊紹昌，浦朝忠，何于雯，孟錦昕，李楠，王靜林*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224； 2.雙江縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，云南 雙江 677399；3.雙江縣勐勐鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心，云南 雙江 677399)

搖蚊科昆蟲(Chironomidae)屬于昆蟲綱、有翅亞綱、雙翅目、長角亞目[1]。2012年全世界已經(jīng)記錄了11個(gè)亞科400多個(gè)屬6300多種搖蚊[2,3]。在中國目前已記錄有大約1000種搖蚊，分布在長足搖蚊亞科、直突搖蚊亞科、原寡角搖蚊亞科、寡角搖蚊亞科、寡脈搖蚊亞科、濱海搖蚊亞科、搖蚊亞科等7個(gè)亞科，139個(gè)屬[4]。搖蚊在全球地理分布區(qū)域非常廣泛，其幼蟲在淡水水體中種類最多。搖蚊在環(huán)境監(jiān)測、水產(chǎn)品良好的天然餌料及養(yǎng)殖等方面具有較好運(yùn)用前景[5-7]；部分搖蚊為農(nóng)業(yè)害蟲，不僅危害蓮藕，還會(huì)捕食仔魚，并傳播疾病[8]。因此，對(duì)搖蚊的系統(tǒng)研究、環(huán)境評(píng)價(jià)、水產(chǎn)品養(yǎng)殖等方面具有重要意義。為此，2020年4月筆者在云南省雙江縣采集搖蚊，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)采集到的4種搖蚊進(jìn)行了鑒定，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集及初步分類

2020年4月23日18:00至次日8：00在云南省雙江縣布京村大勐峨組一黃牛養(yǎng)殖場牛圈內(nèi)采用燈誘方法(功夫小帥，12V， 300mA， 湖北武漢)進(jìn)行昆蟲標(biāo)本采集[9]。將采集到的標(biāo)本放入-20℃冰箱中冷凍致昆蟲死亡，在體視顯微鏡下挑選出搖蚊，并根據(jù)形態(tài)特征對(duì)搖蚊進(jìn)行初步鑒定，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，不同形態(tài)搖蚊標(biāo)本放入1.5mL離心管加入1mL 70%乙醇浸泡，編號(hào)，4℃保存。

1.2 搖蚊形態(tài)學(xué)鑒定

從離心管中取出搖蚊標(biāo)本，切下昆蟲翅膀，在光學(xué)顯微鏡下觀察昆蟲形態(tài)學(xué)特征。蟲體加入200μL消化液，40℃金屬浴放置過夜[10]。

1.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增

用DNA提取試劑盒(天根公司)按說明書從上述消化液中提取搖蚊基因組DNA，取2μL 搖蚊基因組DNA做模板，依次加入2.5μL 10×Buffer、2μL 2.5mmol/L dNTP、0.5μL COI基因上游引物[11]、0.5μL COI基因下游引物[11]、9.5μL 去離子水，參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增條帶，PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司(昆明測序部)進(jìn)行測序。

1.4 序列分析

分別使用DNA Star軟件中SeqMan和MegAlign進(jìn)行序列拼接和核苷酸同源性分析。使用MEGA X 軟件構(gòu)建最大似然法(ML)系統(tǒng)進(jìn)化樹，篩選DNA最佳模型，bootstrap值為1000。

2 結(jié)果

2.1 搖蚊采集

2020年4月23日在云南省雙江縣布京村大勐峨組黃牛養(yǎng)殖場采集到搖蚊160只，其中雌搖蚊151只(94.4%)、雄搖蚊9只(5.6%)。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

采集的160只搖蚊身體黑色，翅膀上均有明顯的淡色和暗色斑塊，按翅膀上淡斑和暗斑的形態(tài)、大小、位置，把采集到的160只搖蚊分為4類，第一類(以SJ2為代表)翅面有4個(gè)大小不等、不規(guī)則、明顯的暗斑(見圖1 A)，第1個(gè)暗斑較大，位于中1室靠近基部1/4處，暗斑下緣超過中2脈；第2個(gè)暗斑較小，位于中2室中部，暗斑下緣不超過中3+4脈；第3個(gè)暗斑成矩形，覆蓋中肘叉并超過肘1脈抵達(dá)翅下緣；第4個(gè)暗斑上緣覆蓋肘2脈，向下覆蓋臀室中部，但下緣未抵達(dá)翅下緣。 第二類(以SJ26為代表)翅面有4個(gè)大小不等、不規(guī)則、明顯的暗斑(見圖1 B)，第1個(gè)、第3個(gè)暗斑位置大小形態(tài)與SJ2相似；第4個(gè)暗斑位置與SJ2相似，但形態(tài)與SJ2有明顯區(qū)別，呈不規(guī)則形；第2個(gè)暗斑為長條形，上緣起于中1脈，暗斑前端開始于靠近基部2/10處向后到達(dá)7/10處，暗斑下緣與中3+4脈形成一白色條帶。第三類(以SJ22為代表)翅面有4個(gè)大小不等、不規(guī)則、明顯的暗斑(見圖1 C)，第1個(gè)、第3個(gè)和第4個(gè)暗斑位置大小形態(tài)與SJ2相似；第2個(gè)暗斑位置與SJ2相似，但比SJ2大，暗斑端部明顯，靠近基部有點(diǎn)模糊。第四類(以SJ24為代表)翅面有5個(gè)大小不等、不規(guī)則、明顯的暗斑(見圖1 D)，第1個(gè)、第2個(gè)、第3個(gè)和第4個(gè)暗斑位置大小形態(tài)與SJ26相似，但在中1室端部還存有一個(gè)顏色較淺的暗斑。

A.SJ2；B.SJ26；C.SJ22；D.SJ24。

2.3 搖蚊分子鑒定

2.3.1核苷酸同源性分析

分別選取雙江縣采集到的不同形態(tài)的11只搖蚊(編號(hào)分別為SJ1、SJ2、SJ3、SJ19、SJ20、SJ21、SJ22、SJ23、SJ24、SJ25、SJ26)進(jìn)行昆蟲COI基因擴(kuò)增，序列測定分別獲得每只搖蚊437個(gè)核苷酸(nt)序列。同源性分析結(jié)果顯示，雙江縣采集的11只搖蚊COI基因核苷酸同源性在84%～100%，其中SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊COI基因核苷酸同源性在99.3%～100%，而與其他5只搖蚊核苷酸同源性均低于86%；SJ21和SJ22兩只搖蚊核苷酸同源性為97.7%，而與其他9只搖蚊核苷酸同源性均低于87%；SJ25和SJ26兩只搖蚊核苷酸同源性為99.8%，而與其他9只搖蚊核苷酸同源性均低于90.2%；SJ2與SJ25和SJ26核苷酸同源性最高僅為89.9%～90.2%，而與其他8只搖蚊核苷酸同源性均低于87%。11只搖蚊COI基因核苷酸與GenBank中20種27條已知搖蚊相應(yīng)序列一起進(jìn)行分析(見表1)，SJ2與2013年在云南省勐?？h采集的、2011年在浙江衢州采集的以及2013年在日本茨城采集的P.japonicum核苷酸同源性最高在91.5%～99.5%，而與其他搖蚊核苷酸同源性均在90.6%以下；SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊與2014年在云南省勐臘縣采集的Polypedilumsp3 SC(KU497064)核苷酸同源性最高在99.3%～100%，而與其他已發(fā)現(xiàn)搖蚊核苷酸同源性均低于89%；SJ21和SJ22兩只搖蚊與2013年云南省勐?？h采集的Polypedilumsp2 SC(KU497084)、Polypedilumsp2 SC (KU497066)和Polypedilumsp2 SC (KU497059)搖蚊核苷酸同源性最高在97.3%～99.5%，其次與2015年在廣西河池采集的Polypedilumsp2 SC (KU497090)較高核苷酸同源性最高在92.7%～94.1%，而與其他搖蚊核苷酸同源性均在89.7%以下； SJ25和SJ26兩只搖蚊與2013年在云南省勐?？h采集的P.scalaenum核苷酸同源性最高在97.3%～97.9%，而與其他搖蚊核苷酸同源性均低于90.6%。

表1 云南省雙江縣4種搖蚊COI基因核苷酸序列同源性分析

2.3.2COI基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

將11只搖蚊COI基因與GenBank 中不同搖蚊種類相應(yīng)基因27條序列一起構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹，選用GTL+G+I模型為最佳DNA模型，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上雙江縣采集的11只搖蚊與選用的22條多足搖蚊屬(Polypedilum)搖蚊位于同一較大的進(jìn)化分支內(nèi)，提示本次在雙江縣采集到的搖蚊均為多足搖蚊屬搖蚊。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)本次雙江縣采集的11只多足搖蚊屬搖蚊分別位于4個(gè)進(jìn)化分支內(nèi)， SJ2與4條P.japonicum序列形成同一進(jìn)化分支；SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊與Polypedilumsp3 SC(KU497064)搖蚊序列形成同一進(jìn)化分支；SJ21和SJ22兩只搖蚊與Polypedilumsp2 SC(KU497084)、Polypedilumsp2 SC (KU497066)、Polypedilumsp2 SC (KU497059)和Polypedilumsp2 SC (KU497090)搖蚊序列形成同一進(jìn)化分支；SJ25和SJ26兩只搖蚊與P.scalaenum搖蚊序列形成同一進(jìn)化分支(見圖2)。以上分析結(jié)果提示SJ2搖蚊可能是P.japonicum，SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊可能是與Polypedilumsp3 SC(KU497064)相同種類的搖蚊，SJ21和SJ22兩只搖蚊是與Polypedilumsp2 SC(KU497084、KU497066、KU497059) 相同種類的搖蚊，SJ25和SJ26兩只搖蚊可能是P.scalaenum搖蚊。

2.4 分類鑒定結(jié)果

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法明確采集搖蚊種類后，對(duì)采集到的160只搖蚊進(jìn)行分類(見表2)，結(jié)果顯示存在4種多足搖蚊屬搖蚊，其中多足搖蚊屬Polypedilumsp3 SC搖蚊為優(yōu)勢種，占全部采集搖蚊數(shù)量的81.25%；其次為與Polypedilumsp2 SC(KU497084)種類相似的多足搖蚊屬搖蚊，占全部采集搖蚊數(shù)量的11.25%，P.japonicum和P.scalaenum兩種搖蚊數(shù)量較少，僅占全部采集搖蚊數(shù)量的7.5%。

采用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，最佳模型選用(GTR+G+I)；圓點(diǎn)代表本次采集到搖蚊標(biāo)本。

表2 云南省雙江縣黃牛養(yǎng)殖場搖蚊種群構(gòu)成

3 討論

本研究在雙江縣采集到的搖蚊翅面上均有明顯的淡、暗斑，根據(jù)暗斑數(shù)量、形態(tài)、位置、大小分為4類，同樣COI基因序列分析結(jié)果也顯示了翅面上形態(tài)學(xué)上不同的4類搖蚊也分別位于不同的4個(gè)進(jìn)化分支內(nèi)，提示本次在雙江縣采集的搖蚊可能為4個(gè)不同的種類。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示SJ2與P.japonicum遺傳進(jìn)化關(guān)系密切，SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊與Polypedilumsp3 SC遺傳進(jìn)化關(guān)系密切，SJ21和SJ22兩只搖蚊與Polypedilumsp2 SC遺傳進(jìn)化關(guān)系密切，而SJ25和SJ26兩只搖蚊與P.scalaenum遺傳進(jìn)化關(guān)系密切，提示云南省雙江縣存在P.japonicum、Polypedilumsp3 SC、Polypedilumsp2 SC和P.scalaenum等4種多足搖蚊屬搖蚊。

本次雙江縣采集到的4種多足搖蚊屬搖蚊，除P.japonicum翅面有5個(gè)暗斑外，P.sp3 SC、P.sp2 SC和P.scalaenum均有4個(gè)暗斑，中1室、中肘叉-肘1脈、臀室暗斑形態(tài)、位置相似，僅靠這3個(gè)暗斑難于區(qū)分，這3種多足搖蚊屬搖蚊主要依據(jù)中2室暗斑大小、位置、形態(tài)的不同來進(jìn)行區(qū)分。因此，中2室暗斑是形態(tài)學(xué)鑒定P.sp3 SC、P.sp2 SC和P.scalaenum等搖蚊種類的重要特征。

目前，在世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了8個(gè)亞屬520種多足搖蚊屬(PolypedilumKieffer，1912)搖蚊，該屬搖蚊地理分布范圍非常廣泛[12]。在中國目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多足搖蚊屬搖蚊大約90種[13]。近年來，在云南省西雙版納州勐?？h和勐臘縣以及保山市高黎貢山等地區(qū)的調(diào)查中共發(fā)現(xiàn)了P.japonicum、P.scalaenum、P.tsukubaense、P.xianjuensis、P.asakawaense、P.nubifer、P.yongsanensis、P.genpeiense、P.cochlearum、P.spathum、P.decematoguttatum、P.heberti、P.cf.okigrandis、P.cf.alticola、P.bingoparadoxum、P. 8SC、P.sp4SC、P. 6SC、P.sp5SC、P.sp2SC、P.sp3 SC等21種多足搖蚊屬搖蚊[12,14]。本研究再次在云南省臨滄市雙江縣布京村大勐峨組黃牛養(yǎng)殖場采集到了P.japonicum、P.scalaenum、P.sp3 SC 、P.sp2 SC等4種多足搖蚊屬搖蚊，表明了這幾種多足搖蚊屬搖蚊在云南省南部邊境地區(qū)分布較為廣泛。

雙江縣位于云南省西南部，氣溫較高，氣候濕潤，植被較好，有利于多種昆蟲存在和繁殖。搖蚊與蠓蟲外形相似，常常被誤認(rèn)為不吸血蠓蟲[12]。本次研究在雙江縣大勐峨村黃牛養(yǎng)殖場采集蠓蟲中，同時(shí)采集到一些體型相似、翅面上具有淡暗斑的昆蟲，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為4種多足搖蚊屬搖蚊。該研究不僅豐富了我國搖蚊種類資源，也對(duì)搖蚊生態(tài)學(xué)、水產(chǎn)品天然餌料及養(yǎng)殖、水體污染、農(nóng)業(yè)危害等方面進(jìn)一步的研究具有重要意義。