許飛，李玲，馬慧

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 血液科，寧夏 銀川 750004）

0 引言

急性髓細胞白血?。ˋML）是以異常分化的髓系細胞對骨髓，血液和其他組織的浸潤為特征的血液系統(tǒng)惡性腫[1]。雖然目前AML的完全緩解率（CR）可達到60%-80%，然而之后仍存在較高的復(fù)發(fā)率。而微小殘留?。∕RD）是AML復(fù)發(fā)的主要原因，MRD 是指AML經(jīng)化療后或骨髓移植后體內(nèi)殘留微量白血病細胞。準確動態(tài)評估AML患者治療后的MRD 對盡早預(yù)測復(fù)發(fā)、評價療效、指導(dǎo)個體化治療、有效地延長患者生存期均有重要意義[2]。同時進一步研究MRD特征性分子標志對監(jiān)測MRD具有重要價值。WT1基因存在于11p13q染色體，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子通過參與造血干細胞正常分化與促進細胞異常過度增殖兩個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。許多血液系統(tǒng)腫瘤及實體腫瘤均高表達WT1基因，特別是在白血病中，WT1基因的表達被作為白血病細胞存在的標志。同時，有研究報道WT1的mRNA表達水平與白血病疾病活動情況密切相關(guān)[3]。因此，本研究進一步探討WT1的mRNA水平是否可以作為AML微小殘留病的監(jiān)測指標及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 研究對象。2017年 6月至 2019年 6月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液內(nèi)科收治住院64例初發(fā)AML患者。所有AML患者均符合國際FAB診斷標準，經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學(xué)、免疫表型、細胞核型和分子生物學(xué)結(jié)果確診。其FAB分型見表1。誘導(dǎo)治療及緩解后治療均參照成人急性髓細胞白血病診療指南[4]。經(jīng)誘導(dǎo)緩解治療后，其中46例患者達完全緩解，并進行長期隨訪，其中15例患者復(fù)發(fā)。通過多參數(shù)流式細胞術(shù)（MFC）檢測完全緩解（CR）及每次鞏固化療后 MRD 水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），RT-PCR 檢測每次鞏固化療后骨髓 WT1 基因表達水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），同時檢測骨髓細胞形態(tài)學(xué)的變化。此外，所有患者均簽署知情同意書并通過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 WT1定量檢測。抽取患者骨髓，用Ficoll分離骨髓單個核細胞，Trizol法提取總RNA，應(yīng)用NanoDrop 2000分光光度儀檢測RNA濃度及純度，所有樣本符合A260/A280 ≥1.8。取1ug RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，并應(yīng)用一步法RT-qPCR WT1試劑盒；反應(yīng)條件：42攝氏度30分鐘，94攝氏度變性5分鐘，94攝氏度變性15秒，60攝氏度退火1分鐘，循環(huán)40次。擴增反應(yīng)在ABI 7500（美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品）中進行，內(nèi)參基因選用ABL基因。

1.3 MFC檢測MRD。選擇髓系抗原：CyMPO、CD13、CD33、CDw65、CD14、CD15、CD64、CD117等。取1×106個骨髓細胞與上述抗體在室溫孵育15分鐘，用氯化銨溶血后加生理鹽水300G 5分鐘離心洗滌一次，棄上清，用生理鹽水懸浮細胞，并應(yīng)用Cytomics? FC-500 流式細胞儀進行檢測。分析 CD45/SS 散點圖的各群細胞抗原表達情況，取10000 個細胞，通過計算得出表達目標抗原的細胞之和所占細胞總數(shù)的百分比。本研究選取閾值為1%，MRD>1%為高水平，≤1%為低水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理。采用 SPSS 23．0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間WT1 mRNA水平比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗，率的比較用χ2檢驗，相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman相關(guān)系數(shù)，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 64例AML患者的一般資料

2 結(jié)果

2.1 WT1 mRNA水平在AML患者初發(fā)、CR及復(fù)發(fā)期的變化。RT-qPCR證明WT1表達在初發(fā)AML患者中的表達明顯高于CR及復(fù)發(fā)期表達水平（P<0.01），見圖1；在AML各亞型間M3的WT1表達最高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖2。

2.2 AML患者CR后骨髓MRD與WT1表達水平的相關(guān)性。對AML患者CR狀態(tài)的骨髓行MRD及WT1基因表達水平相關(guān)性分析，結(jié)果提示二者呈正相關(guān)（r=0.47，P<0.01）。

圖1 WT1 mRNA表達水平在AML初發(fā)患者、完全緩解及復(fù)發(fā)組中的差異

圖2 WT1 mRNA表達水平在AML患者不同亞型（M1-M6）中的比較

2.3 聯(lián)合動態(tài)監(jiān)測AML患者CR后骨髓MRD及WT1表達水平與AML復(fù)發(fā)的關(guān)系。46例AML患者CR后，骨髓MRD與WT1任一水平增高組20例，復(fù)發(fā)11例（55%）骨髓MRD與WT1均水平降低組18例，復(fù)發(fā)2例（11%），兩者復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

WT1 基因于1990年被學(xué)者Call首次發(fā)現(xiàn)[5]，目前許多研究認為 WT1基因具有轉(zhuǎn)錄抑制及激活的雙重作用，其能在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等實體腫瘤中的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用[6]。之后的研究進一步發(fā)現(xiàn)WT1特殊的雙向調(diào)控作用也參與了造血細胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并影響其增殖和分化，同時對造血細胞的凋亡也具有重要作用[7]。有文獻報道WT1基因在幼稚細胞中高表達并抑制分化，具有癌基因特征。有學(xué)者報道初發(fā)AML患者中高表達WT1基因提示預(yù)后更差。

本研究發(fā)現(xiàn)，在初發(fā)AML患者中其WT1基因表達水平明顯高于完全緩解期，且復(fù)發(fā)期較完全緩解也明顯升高，說明WT1轉(zhuǎn)錄水平與AML臨床緩解和復(fù)發(fā)有關(guān)，與Marjanovic等學(xué)者報道結(jié)果一致[8]。在AML各亞型之間，我們發(fā)現(xiàn)M3的WT1表達水平最高，而M1的表達水平最低，與YingChan等學(xué)者結(jié)果一致[9]。在進行AML患者MRD和WT1水平相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)，對CR 后規(guī)律治療的 46例患者進行 MRD及WT1 表達水平監(jiān)測，發(fā)現(xiàn) CR 期間 WT1 表達增高者復(fù)發(fā)率明顯增高。進一步提示W(wǎng)T1基因表達可以在分子層面作為AML患者MRD的一項監(jiān)測指標。因此應(yīng)用RT-qPCR的方法檢測WT1基因表達可作為MRD檢測及AML疾病復(fù)發(fā)的標志，并根據(jù) MRD 及 WT1 表達水平的變化及時調(diào)整治療方案，給予有效的干預(yù)，可明顯減低復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后。

另一方面由于 WT1 基因在AML患者中高表達，以其作為治療靶點的基因腫瘤疫苗也逐漸被人們關(guān)注和研究，現(xiàn)已有進入臨床試驗的相關(guān)腫瘤疫苗[10]，后續(xù)我們將進一步擴大樣本量驗證上述結(jié)果，同時在分子水平探討WT1參與AML的發(fā)生機制。