潘振奇，付冬梅，苑曉倩，王越

（大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧 大連 116034）

啤酒花是啤酒釀造的重要原料，它賦予了啤酒爽口的苦味和特有的香味。啤酒花可以在釀造過程中的麥汁煮沸、回旋沉淀、發(fā)酵、貯酒等任何階段添加。其中，在麥汁發(fā)酵和貯酒過程中添加酒花的方式，稱為“干加酒花”（dry hopping）[1]。干加酒花是一種冷浸漬發(fā)酵工藝，酒花不經(jīng)煮沸，以顆?；蛉ㄐ问皆诎l(fā)酵過程或儲藏期添加，可以達到增加啤酒香氣的目的，這種工藝已成為啤酒行業(yè)研究的熱點[2-4]。干加酒花工藝現(xiàn)在之所以能在啤酒生產(chǎn)中應用，是釀酒師認為啤酒花除了可以賦予啤酒酒花香氣，還具有抑制啤酒中雜菌的生長、維護生物穩(wěn)定性的作用。已有的研究表明酒花中的主要成分由α-酸由葎草酮、輔葎草酮和加葎草酮構(gòu)成，能夠抑制無酒花抗性的微生物存活，如短乳桿菌[5]。李憲臻等[6]認為酒花苦味酸能破壞細胞跨膜pH值梯度而抑制微生物生長。酒花苦味酸作為質(zhì)子載體，通過破壞質(zhì)子移動勢的跨膜pH值梯度，使細胞內(nèi)pH值降低而影響細胞營養(yǎng)轉(zhuǎn)運和代謝過程，從而抑制對酒花敏感菌的生長[7-8]。盡管酒花已經(jīng)被證實具有抑菌作用，但是由于酒花顆粒的加工和儲存條件的差異，同時，干加酒花工藝在中國啤酒生產(chǎn)中的應用剛剛起步，相關的研究正在進行，因此該工藝對啤酒的生物穩(wěn)定性會帶來怎樣的影響尚未可知。

從啤酒的生物穩(wěn)定性來看，啤酒是保壓兼性厭氧發(fā)酵，生成酒精和 CO2，表壓 0.8 MPa～1.2 MPa，對微生物而言并不是理想的生存環(huán)境。但是，由于發(fā)酵設備和管路中不可避免會有滅菌的死角，長期積累，一些微生物如乳酸菌、野生酵母等仍能以啤酒殘?zhí)?、氨基酸、發(fā)酵副產(chǎn)物和微量元素等作為生長因子而生存[9]。當污染微生物達到一定數(shù)量時，對發(fā)酵過程及酒體口味均會產(chǎn)生不良影響，會與酵母進行營養(yǎng)競爭，進而影響酵母的代謝，導致啤酒發(fā)酵異常，對啤酒的穩(wěn)定性和風味會產(chǎn)生一定的影響[10-11]。徐巖等[12]對啤酒釀造過程中的腐敗菌進行了研究，發(fā)現(xiàn)污染細菌后發(fā)酵過程中的pH值下降迅速，異戊醇、異丁醇和總酸偏高。田小群等[13]從啤酒廠分離出31株啤酒腐敗菌，對其進行了生理生化檢驗和16S rDNA測序，結(jié)果表明31株菌分屬 5個種 Lactobacillus brevis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus conostoc、Lactobacillus citreum，其中部分腐敗菌對啤酒的風味影響較大，導致啤酒醇、酯類和總酸提高。

本研究從干加酒花啤酒工藝的常用的酒花顆粒中分離微生物，并進行生理生化和分子鑒定，研究了啤酒花顆粒中的微生物對啤酒風味的影響，為干加酒花工藝制備的啤酒研究和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒花顆粒：上海金啤有限公司（均為鋁箔紙袋5℃密封條件下保存）；酵母：Saccharomyces cerevisiae，由大連工業(yè)大學生物催化技術(shù)國家與地方聯(lián)合實驗室保存。

正丙醇（＞99.8%）、乙酸乙酯（＞99.9%）、乙酸異戊酯（＞99.5%）、乙酸異丁酯（＞99.5%）、異丁醇（＞99.5%）、異戊醇（＞99.8%）、辛酸乙酯（＞99.8%）、色胺（＞99%）、腐胺（＞98%）、酪胺（＞98%）、亞精胺（＞97%）、精胺（＞97%）：中國醫(yī)藥（集團）上海醫(yī)藥有限公司。

細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DL3000 DNA Marker、TransTaq-T DNAPolymerase（250U）、10×TransTaq-TBuffer、2.5mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）、6×DNA Loading Buffer：美國 Trans Taq公司。

1.2 培養(yǎng)基

麥汁培養(yǎng)基：8°P麥汁；史娃茲鑒別培養(yǎng)基（schwartz differential medium，SDM）：動物組織消化物 5.0 g/L、酵母浸粉3.0 g/L、麥芽浸粉3.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、糊精0.11 g/L、亞硫酸鈉 2.92 g/L、堿性品紅0.47 g/L、瓊脂15.0g/L；麥汁碳酸鈣固體培養(yǎng)基：8°P麥汁、瓊脂20g/L、碳酸鈣20 g/L；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉 5 g/L、瓊脂 15 g/L～20 g/L；NBB 培養(yǎng)基：上海子起生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

H1750R離心機：湘儀離心機儀器有限公司；PM1000高效液相色譜：日立高新技術(shù)（上海）國際貿(mào)易有限公司；7890B氣相色譜儀：美國Agilent（安捷倫）科技公司；100 L啤酒生產(chǎn)設備：哈爾濱漢德輕工醫(yī)藥裝備有限責任公司；T1000聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國 Bio-Rad 公司。

1.4 方法

1.4.1 酒花微生物的篩選

取常用的干加酒花顆粒（均為鋁箔紙袋5℃密封條件保存），按5%比例加入麥汁培養(yǎng)基中，30℃搖床富集培養(yǎng)48 h，自然沉降后收集上清菌液，用無菌生理鹽水按梯度稀釋至10-1～10-5，分別涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SDM培養(yǎng)基和麥汁碳酸鈣固體培養(yǎng)基中，按照菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果，采用平板劃線法進一步分離。

復篩：將分離得到的菌株接種于NBB固體培養(yǎng)基中25℃厭氧培養(yǎng)3 d～5 d，挑取生長菌落，斜面營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基保存。

1.4.2 酒花微生物的計數(shù)

取10 g酒花顆粒加入100 mL無菌水中，28℃振蕩1 h，自然沉降后收集上清菌體原液，用無菌生理鹽水按梯度稀釋至10-1～10-5，采用固體培養(yǎng)基菌落計數(shù)法，微生物數(shù)量約為600 cfu/g酒花。

1.4.3 酒花微生物的鑒定

形態(tài)觀察及生理生化鑒定：參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]對分離的微生物進行形態(tài)觀察和生理生化鑒定。

分子生物學鑒定：采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板對菌株的16S rDNA進行PCR擴增。PCR擴增引物16S rDNA通用引物為[15]：1492R、27F；PCR 擴增體系 30 μL：10×buffer3μL，10×TransTaq-T 0.2μL，引物P1和P2各3 μL，DNA 模板 1 μL，dNTPs 2 μL，ddH2O 17.8 μL。PCR 擴增程序：預變性10min，94℃變性30s，55℃退火30s，72 ℃延伸1 min，29個循環(huán)；72℃再延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。將PCR擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進行測序。

將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment searchtool，BLAST）比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA-X 10.1軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.4 干加酒花啤酒發(fā)酵

將麥汁煮沸1 h，冷卻到18℃。取3 L麥汁于殺菌過的5 L發(fā)酵罐中，加入啤酒酵母5×106個/mL，安裝發(fā)酵栓，在發(fā)酵栓內(nèi)注入5mL2.61mol/L硫酸溶液封口。由于Saccharomyces cerevisiae釀造啤酒通常在18℃～20℃下發(fā)酵[16]，因此，本試驗采用20℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵，取分離純化的微生物接種于麥汁中，培養(yǎng)24 h后，按照酒花顆粒中菌落數(shù)，在入罐24 h的啤酒發(fā)酵液中添加1.8×105個/hL的酒花微生物菌落（按干加酒花量為300 g/hL折算），以未加微生物的啤酒發(fā)酵液作空白，以干加300 g/hL酒花為比較對象。考慮到酒花微生物對啤酒發(fā)酵結(jié)束后風味和品質(zhì)的影響，待發(fā)酵液比重降到1.007 0以下，發(fā)酵結(jié)束，檢測發(fā)酵液總酸、風味物質(zhì)和生物胺。

1.4.5 啤酒總酸測定

參照 GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[17]。

1.4.6 啤酒低揮發(fā)性風味物質(zhì)的檢測

樣品測定[18]：取5 mL過濾后的待測液加入頂空進樣瓶中，加內(nèi)標物（正丁醇）1 μL。立即加密封墊和鋁蓋并壓緊，將樣品置于頂空進樣器上，利用保留時間定性，峰面積定量的內(nèi)標法進行各風味物質(zhì)含量的計算。氣相色譜條件：安捷倫7890B毛細管柱，HP-5色譜柱（30m×0.32mm×0.5μm），進樣口溫度200℃，檢測器溫度230℃，氫氣 45 mL/min，空氣 450 mL/min；載氣（氮氣）8 mL/min；采用分流進樣，分流比1∶1；色譜柱升溫程序：38℃保溫2 min，10℃/min升溫至60℃保溫 0 min，20℃/min升溫至 120℃，40℃/min升溫至200℃保溫0 min。頂空進樣條件：樣品瓶加熱溫度55℃；進樣針溫度65℃；傳輸溫度120℃；加熱時間36 min。循環(huán)時間20 min；進樣時間0.2 min；抽樣時間0 min；載氣壓力 19 Pa。

1.4.7 啤酒生物胺液相檢測

樣品處理[19]：將樣品于4℃，10 000 r/min條件離心10 min，取上清液10 mL于燒杯中，加氯化鈉過飽和溶液，再添加0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH12，取5 mL樣品于15 mL離心管，加入5 mL正丁醇/三氯甲烷（1∶1，體積比）混合，振蕩5 min，4℃3 600 r/min離心10 min，重復上述兩次，合并萃取液。加入0.1 mL 1 mol/L鹽酸，氮吹儀水?。?0℃）吹干，加入1 mL 0.1 mol/L鹽酸溶解后，溶液進行衍生。生物胺衍生測定方法：取上述處理后溶液0.5 mL于10 mL試管，加入1 mL丹磺酰氯和1.5 mL飽和碳酸氫鈉，60℃烘箱靜置15 min，取出后加入1 mL純水搖勻。氮吹儀水?。?0℃）吹至3 mL，加入3 mL乙醚，振蕩2 min。吸取萃取液于15 mL離心管中，重復上述步驟，合并萃取液，氮吹儀水?。?0℃）吹干，最后用1 mL甲醇溶解殘留物，待用。液相色譜條件：色譜柱為 C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；紫外檢測波長為254 nm；流動相A為甲醇溶液，B為超純水，流速為1 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30℃。

1.4.8 數(shù)據(jù)處理

利用Excel與SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，使用MEGA-X 10.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒花微生物的分離與鑒定

從酒花顆粒中按照方法“1.4.1”經(jīng)初篩未檢出霉菌、乳酸菌和酵母，只在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上有細菌菌落，具體見圖1。復篩經(jīng)NBB厭氧培養(yǎng)共獲得3株菌分別編號為Y1、Y2、Y4，其生理生化試驗結(jié)果見表1。

圖1 3株細菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of 3 strains of bacteria

表1 3株細菌生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Morphological and physiological and biochemical results of 3 strains of bacteria

由圖1可知，Y1的菌落呈白色，表面褶皺且邊緣不規(guī)則，菌落中央凹陷；Y2菌落呈淺黃色，表面及邊緣光滑；Y4菌落呈乳白色，邊緣褶皺不規(guī)則且較薄。由表1可知，3株菌都能利用葡萄糖和蔗糖，Y1和Y4菌不能利用半乳糖和蜜二糖，3株菌革蘭氏染色為陽性，都具有過氧化氫酶活性，能耐受10%的鹽度，能在10℃～45℃范圍內(nèi)生長，該生理生化特征與Bacillus和Terribacillus相似，初步判斷為芽孢桿菌[20-22]。

基于16SrDNA序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

由圖2可知，菌株Y1與Bacillus velezensis strain ND聚于一支，Y2與Terribacillus saccharophilus strain MER 108聚于一支，Y4與Bacillus sp.C87聚于一支，親緣關系最近。由NCBI Blast同源性分析，Y1菌與Bacillus velezensis strain ND同源性達100%，Y2菌與Terribacillus saccharophilus strain MER 108的同源性達99%，Y4與Bacillus sp.C87同源性達99.93%。根據(jù)生理生化測定結(jié)果和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析及序列同源性比對，可將3個菌株鑒定為：Y1為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），Y2為嗜糖土地芽孢桿菌（Terribacillus saccharophilus），Y4 為芽孢桿菌（Bacillus sp.）。

2.2 酒花微生物對啤酒發(fā)酵風味的影響

2.1試驗表明啤酒花顆粒中存在著Bacillus和Terribacillus。當啤酒采用干加酒花工藝釀造時，這些細菌會隨著酒花顆粒進入到發(fā)酵液中，降低啤酒的生物穩(wěn)定性。有研究表明[23-24]，啤酒腐敗菌乳酸桿菌代謝產(chǎn)物如乳酸、乙酸等有機酸會改變啤酒的風味，并引起啤酒酪胺、組胺等生物胺的提高，導致啤酒腐敗。一些芽孢桿菌如地衣芽胞桿菌、蠟樣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型與釀酒酵母混合培養(yǎng)后會提高釀酒酵母代謝高級醇類和酯類化合物的能力[12]。因此，為研究干加酒花工藝時啤酒花顆粒中細菌對啤酒風味的影響，分別將從酒花顆粒中篩選到的Y1、Y2和Y4接種到啤酒發(fā)酵液，檢測總酸、低沸點揮發(fā)性物質(zhì)和生物胺的變化。

2.2.1 對啤酒總酸的影響

在入罐24 h的啤酒發(fā)酵液中分別添加Y1、Y2、Y4菌和酒花，按照方法“1.4.4”中的量添加，以未加細菌的啤酒發(fā)酵液作空白，在20℃發(fā)酵結(jié)束后，測定啤酒的總酸，結(jié)果見圖3。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rDNA sequence based phylogenetic tree of the strains

圖3 干加酒花對啤酒總酸的影響Fig.3 Effect of dry hopping on total acid of beer

由圖3可以看出，與空白比較，干加酒花后，啤酒的總酸增加了12%。有文獻報道[25]，啤酒中酸類物質(zhì)主要來源于麥芽中的酸和發(fā)酵產(chǎn)酸。干加酒花促進了啤酒總酸的提高，分析其原因，盡管酒花樹脂含有α-酸和β-酸，但是溶解度很低，約為4.70×10-5mL/100 mL～27.6×10-5mL/100 mL[26]。因此總酸度提高可能和酒花中的微生物代謝有關。進而考察了Y1、Y2和Y4菌對啤酒的總酸影響。從圖3看出，3株菌都提高了啤酒總酸，其中Y2菌產(chǎn)酸量最高，達到了2.2 mL/100 mL，比空白提高了32%，但都符合國標GB/T 4928—2008中啤酒總酸小于2.6 mL/100 mL的要求。研究報道蠟樣芽胞桿菌具有耐酸性，其代謝可以產(chǎn)生乳酸、乙酸、丁酸等有機酸[27-28]。因此，干加酒花使啤酒總酸增加可能是由酒花中細菌代謝產(chǎn)酸引起的，且不同微生物對總酸的影響差異較大。

2.2.2 酒花中細菌對啤酒風味物質(zhì)的影響

為研究酒花及酒花中細菌對啤酒風味物質(zhì)的影響，按照方法“1.4.4”在啤酒發(fā)酵液中分別添加Y1、Y2和Y4菌，發(fā)酵結(jié)束后，利用方法“1.4.6”檢測高級醇和酯類物質(zhì)含量，試驗結(jié)果見表2。

表2 啤酒風味物質(zhì)的含量Table 2 Content of flavor substances in beer mg/L

由表2看出，和空白比較，干加酒花的啤酒總醇含量增加了33.63%。作為重要的高級醇風味物質(zhì)，尤其是正丙醇的增加有助于提高啤酒香味，使啤酒香氣更加柔和[29-30]。添加酒花中B.velezensisY1和T.saccharophilusY2菌，啤酒總醇都有所增加，其中投放T.saccharophilusY2菌的啤酒總醇增加了33.23%，結(jié)果說明干加酒花啤酒總醇的增加與酒花中的細菌參與代謝有關。

酯類化合物也是影響啤酒風味的重要組成成分之一。主要酯類風味乙酸異戊酯的風味閾值在2.6 mg/L～6 mg/L之間，會使啤酒呈現(xiàn)出獨特的“香蕉”香味，超出閾值則會產(chǎn)生一種使人不愉快的氣味。乙酸乙酯的風味閾值在26 mg/L～45 mg/L之間會給啤酒帶來水果的果香味，超出閾值會產(chǎn)生不協(xié)調(diào)的、刺鼻的溶劑氣味[31-32]。試驗結(jié)果表明干加酒花的啤酒乙酸異戊酯和乙酸乙酯均在風味閾值內(nèi)，并且干加酒花的啤酒總酯增加了31.48%，投放3種細菌啤酒總酯含量均增加，其中Bacillus sp.Y4使啤酒總酯含量增加54.23%。綜上所述，酒花中的Bacillus和Terribacillus會促進啤酒總酯的增加，對總醇的影響因菌種而異。

2.2.3 啤酒中生物胺的測定

為了考察酒花中細菌對啤酒生物胺的影響，按照方法“1.4.4”在啤酒發(fā)酵液中分別添加細菌和酒花。按照方法“1.4.7”檢測發(fā)酵液生物胺含量，結(jié)果見表3。

由表3看出，和空白比較，干加300 g/hL酒花對啤酒的總生物胺影響明顯，增加了31.11%。PavelKala等[33]在用啤酒乳酸菌混合培養(yǎng)物接種的啤酒中發(fā)現(xiàn)酪胺、組胺和尸胺含量的增加。表明啤酒中的生物胺含量提高與雜菌代謝有關。因而考察了酒花中的細菌對生物胺的影響。從結(jié)果看，B.velezensisY1、T.saccharophilus Y2和Bacillus sp.Y4和酵母混合發(fā)酵都增加了生物胺，分別增加了190.94%、15.88%和32.47%。其中酒花中的B.velezensisY1菌按1.8×105個/hL（按干加酒花量為300 g/hL中所含微生物折算）接入發(fā)酵液時，產(chǎn)生的生物胺達到了27.96 mg/L，超過了啤酒中生物胺的一般限量20 mg/L[34]。試驗表明干加酒花提高了啤酒的生物胺含量，這是由酒花中的Bacillus和Terribacillus的代謝引起的，不同菌種影響也不盡相同，干加酒花工藝對啤酒生物穩(wěn)定性和品質(zhì)會帶來潛在的風險。

表3 啤酒生物胺的含量Table 3 Content of biogenic amines in beer mg/L

3 結(jié)論

干加酒花啤酒作為一種近年來受大眾歡迎的飲品，因其突出的口味和飽滿的香氣而受到市場的青睞。但是在干加酒花過程中，存在被微生物污染的可能，這些微生物通過自身產(chǎn)生或者間接作用于釀酒酵母從而影響啤酒的風味。本文從啤酒花顆粒中分離篩選出3株細菌，經(jīng)生理生化和分子鑒定屬于Bacillus和Terribacillus屬。干加酒花能改變啤酒的總酸、總醇、總酯及生物胺含量。將啤酒花顆粒中篩選到的Y1、Y2和Y4投放于啤酒中，發(fā)現(xiàn)干加酒花對啤酒風味和生物胺的影響主要是由酒花顆粒中細菌的代謝引起的，從而會引起啤酒風味的改變，表明酒花顆粒如果不經(jīng)過殺菌處理，干加酒花工藝對啤酒生物穩(wěn)定性和品質(zhì)會帶來潛在的風險。