杜滿 張莉 李鵬 齊洪梅 鹿秀海

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 山東省眼科研究所 山東省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，濟(jì)南 250021

真菌性角膜炎(fungal keratitis，F(xiàn)K)是一種嚴(yán)重的致盲眼病，常有植物外傷史。目前FK組織病理學(xué)檢查主要采用的染色方法為蘇木精-伊紅染色和特殊染色。蘇木精-伊紅染色在大部分真菌不著色，診斷比較困難，主要用于觀察角膜受感染的病理變化。因此特殊染色在真菌感染診斷中十分必要[1]。過碘酸希夫染色可使真菌細(xì)胞壁顯示紅色，利于觀察，這種方法可顯示大部分真菌。但是在日常工作中發(fā)現(xiàn)，某些FK的病原菌在過碘酸希夫染色中會(huì)著色不良或者不著色，且容易與變性的基質(zhì)纖維混淆，另外，在檢查角膜病灶切除標(biāo)本或者菌絲含量較少的組織時(shí)易漏診。隨著熒光顯微鏡的普及，熒光染色也被應(yīng)用到真菌的檢測(cè)和診斷中，熒光染色液能與真菌細(xì)胞壁的纖維素、幾丁質(zhì)和其他含β-1，4-糖苷鍵的碳水化合物緊密結(jié)合，在紫外激發(fā)光(UA濾鏡)下菌絲細(xì)胞壁及孢子細(xì)胞壁均呈亮藍(lán)綠色，背景呈黑色，真菌的形態(tài)特征十分清晰，不易漏診[2]。國外實(shí)驗(yàn)室早已將熒光顯微鏡用于FK等疾病病原真菌的檢測(cè)[3]，但國內(nèi)尚未將此檢查作為常規(guī)的檢查方法，而且一些特殊菌種所致的FK，過碘酸希夫染色效果較差，容易漏診。本研究對(duì)臨床上采集的FK標(biāo)本分別進(jìn)行熒光染色和過碘酸希夫染色，比較2種方法的診斷效率。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年1月至2019年5月于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院就診且角膜刮片或真菌培養(yǎng)陽性的FK患者147例的角膜標(biāo)本147份，其中行穿透角膜移植術(shù)(penetrating keratoplasty，PKP)患者84例，板層角膜移植術(shù)(lamellar keratoplasty，LKP)患者42例，病灶切除患者21例。147例患者中有146例行角膜刮片病原學(xué)檢查均為陽性，1例未行角膜刮片檢查，同時(shí)所有標(biāo)本均行真菌培養(yǎng)和組織病理學(xué)檢查。選取11例單純皰疹病毒性角膜炎活檢組織作為陰性對(duì)照。本研究經(jīng)山東省眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：SDSYKYY-2016012)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

角膜組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)固定、脫水、透明和浸蠟，4 μm厚切片，切片經(jīng)二甲苯充分脫蠟至水。標(biāo)本除行常規(guī)蘇木精-伊紅染色外，再分別進(jìn)行真菌熒光染色和過碘酸希夫染色。

1.2.1真菌熒光染色 直接向標(biāo)本上滴加1滴真菌熒光染色液(江蘇諾鬲生物科技有限公司)，染色液以覆蓋或淹沒整個(gè)標(biāo)本為準(zhǔn)，使染料與標(biāo)本充分結(jié)合，持續(xù)染色1 min；蓋上蓋玻片，吸去多余染液。熒光顯微鏡下真菌菌絲和孢子呈亮藍(lán)綠色熒光。

1.2.2過碘酸希夫染色 向標(biāo)本上滴加1滴過碘酸染色10 min，水洗，希夫染液(糖原染色試劑盒，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)避光浸染20 min，傾去染液，直接滴加偏重亞硫酸鈉作用1 min，共2次，流水沖洗10 min，蘇木素淡染，脫水、透明、封固。置于光學(xué)顯微鏡下觀察，真菌菌絲和孢子呈紫紅色染色為陽性染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究中計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示。2種染色方法陽性率的比較，以及不同手術(shù)方式切除FK角膜組織2種染色方法的陽性率比較均采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)(McNemar's test)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真菌熒光染色及過碘酸希夫染色鏡下特點(diǎn)

真菌熒光染色組織標(biāo)本菌絲結(jié)構(gòu)清晰，可見橫隔、分枝，角膜基質(zhì)呈淡藍(lán)色，背景呈黑色。過碘酸希夫染色角膜基質(zhì)呈粉紅色(圖1)。

圖1 真菌過碘酸希夫染色和熒光染色鏡下特點(diǎn) A：真菌菌絲和孢子呈紫紅色，角膜基質(zhì)呈粉紅色(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) B：熒光染色可見真菌菌絲和孢子呈亮藍(lán)綠色熒光，菌絲結(jié)構(gòu)清晰，可見橫隔、分枝，角膜基質(zhì)呈淡藍(lán)色，背景呈黑色(×400，標(biāo)尺=100 μm)Figure 1 Fungal samples after periodic acid Schiff staining and fluorescence staining under fluorescence microscope A:PAS stained fungal hyphae and spores were purplish red,and corneal stroma was pink (PAS ×400,bar=100 μm) B:After fluorescence staining,fungal hyphae and spores were bright blue-green fluorescence,and mycelial structure was clear to see transverse septum and branches,and corneal stroma was light blue,and background was black (×400,bar=100 μm)

2.2 真菌熒光染色與過碘酸希夫染色的陽性率比較

過碘酸希夫染色的陽性率為60.5%(89/147)，真菌熒光染色的陽性率為79.6%(117/147)，熒光染色法診斷FK的陽性率高于過碘酸希夫染色法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.00，P<0.01)(表1)，2種染色方法的特異性均為100%。PKP手術(shù)切除標(biāo)本熒光染色的陽性率為85.7%(72/84)，過碘酸希夫染色的陽性率為65.5%(55/84)，熒光染色的陽性率明顯高于過碘酸希夫染色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.00，P<0.01)；LKP手術(shù)切除標(biāo)本熒光染色的陽性率為71.4%(30/42)，過碘酸希夫染色的陽性率為52.4%(22/42)，熒光染色的陽性率明顯高于過碘酸希夫染色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.00，P<0.01)；病灶切除標(biāo)本熒光染色的陽性率為71.4%(15/21)，過碘酸希夫染色的陽性率為57.1%(12/21)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.30，P=0.25)(表2)。11例陰性對(duì)照行熒光染色和過碘酸希夫染色結(jié)果均為陰性。

表1 2種染色方法診斷FK的結(jié)果比較Table 1 Comparison of the diagnostic results of FK by two staining methods染色方法總例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)過碘酸希夫染色1478958熒光染色14711730χ2值28.00P值<0.01 注:(配對(duì)卡方檢驗(yàn)) FK:真菌性角膜炎 Note:(McNemar's test) FK:fungal keratitis

表2 不同手術(shù)方式切除FK角膜組織2種染色方法的陽性率比較Table 2 Comparison of the positive rates of two staining methods for resected corneal tissue with FK by different surgical methods染色方法PKPLKP病灶切除總例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)總例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)總例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)過碘酸希夫染色84552942222021129熒光染色84721242301221156χ2值17.008.001.30P值<0.01<0.010.25 注:(配對(duì)卡方檢驗(yàn)) FK:真菌性角膜炎;PKP:穿透角膜移植術(shù);LKP:板層角膜移植術(shù) Note:(McNemar's test) FK:fungal keratitis;PKP:pentrating keratoplasty;LKP:lamellar keratoplasty

2.3 不同真菌菌株標(biāo)本間真菌熒光染色與過碘酸希夫染色的比較

真菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本共119例，陽性率為81.0%(119/147)。經(jīng)鑒定共23種(屬)真菌，較常見的真菌有黃曲霉復(fù)合群、茄病鐮刀菌復(fù)合群、層生鐮刀菌和鏈格孢霉，分別占31.9%(38/119)、17.6%(21/119)、10.1%(12/119)和9.2%(11/119)。不同菌種所致角膜真菌感染的標(biāo)本熒光染色和過碘酸希夫染色的陽性例數(shù)不同，其中茄病鐮刀菌復(fù)合群、譎詐腐霉菌、煙曲霉復(fù)合群、季也蒙假絲酵母、木霉和鋪葉沼蘭褐鶯真菌熒光染色的陽性例數(shù)分別為19、5、5、1、1和1例，過碘酸希夫染色的陽性例數(shù)分別為11、0、3、0、0和0例。譎詐腐霉、季也蒙假絲酵母、木霉和鋪葉沼蘭褐鶯真菌行過碘酸希夫染色均未見菌絲或孢子，其中譎詐腐霉感染的角膜可見較多平行于角膜基質(zhì)的圓形或長條形空隙，組織中較少見浸潤的炎癥細(xì)胞，譎詐腐霉經(jīng)熒光染色后，可見平行于角膜基質(zhì)內(nèi)生長的菌絲，菌絲較粗且分支少，菌絲的熒光較其他菌種弱。煙曲霉復(fù)合群、刺盤孢和構(gòu)巢曲霉行過碘酸希夫染色后，菌絲染色較淡且結(jié)構(gòu)欠清晰，較易漏診，而經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強(qiáng)，形態(tài)特征明顯、清晰，不易漏診(表3,圖2)。

表3 FK的真菌培養(yǎng)、過碘酸希夫染色及熒光染色結(jié)果比較Table 3 Comparision of fungal culture,periodic acid Schiff staining and fluorescence staining results in FK真菌感染類型總例數(shù)不同方法檢測(cè)真菌感染的陽性標(biāo)本例數(shù)過碘酸希夫染色熒光染色黃曲霉復(fù)合群382729茄病鐮刀菌復(fù)合群211119層生鐮刀菌1279鏈格孢霉1199譎詐腐霉菌505煙曲霉復(fù)合群535鐮刀菌屬434輪枝鐮刀菌444刺盤孢323近平滑念珠菌222肉色鐮刀菌222構(gòu)巢曲霉111季也蒙假絲酵母101尖端賽多孢111離孺孢霉100木霉101鋪葉沼蘭褐鶯真菌101雙胞鐮刀菌111藤倉鐮刀菌復(fù)合群111新月彎孢霉100中介彎孢霉111帚枝霉111無孢霉100合計(jì)11976100 注:FK:真菌性角膜炎 Note:FK:fungal keratitis

圖2 不同菌株的PAS和熒光染色結(jié)果 A：譎詐腐霉感染的角膜可見較多平行于角膜基質(zhì)的圓形或長條形空隙，組織中較少見浸潤的炎癥細(xì)胞(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) B：譎詐腐霉經(jīng)熒光染色后，可見平行于角膜基質(zhì)內(nèi)生長的菌絲，菌絲較粗分支少，菌絲的熒光較弱(×400，標(biāo)尺=100 μm) C：煙曲霉復(fù)合群經(jīng)PAS染色后，菌絲染色較淡，結(jié)構(gòu)欠清晰(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) D：煙曲霉復(fù)合群經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強(qiáng)，形態(tài)特征明顯、清晰(×400，標(biāo)尺=100 μm) E：刺盤孢經(jīng)PAS染色后，菌絲染色較淡，結(jié)構(gòu)欠清晰(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) F：刺盤孢經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強(qiáng)，形態(tài)特征明顯、清晰(×400，標(biāo)尺=100 μm) G：構(gòu)巢曲霉經(jīng)PAS染色后，菌絲染色較淡，結(jié)構(gòu)欠清晰(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) H：構(gòu)巢曲霉經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強(qiáng)，形態(tài)特征明顯、清晰(×400，標(biāo)尺=100 μm)Figure 2 PAS staining and fluorescence staining results of different strains A:More round or long strip spaces parallel to the corneal stroma were observed in the cornea infected by Pythium insidiosum,and infiltrated inflammatory cells were fewer in the tissue (PAS ×400,bar=100 μm) B:After fluorescence staining,the hyphae of Pythium insidiosum growing parallel to the corneal stroma had few thick branches and weak fluorescence (×400,bar=100 μm) C:After PAS staining,the hyphae staining of Aspergillus fumigatus complex was light and the structure was not clear (PAS ×400,bar=100 μm) D:After fluorescence staining,the hyphae fluorescence of Aspergillus fumigatus complex was strong,and the morphological characteristics were obvious and clear (×400,bar=100 μm) E:After PAS staining,the hyphae staining of Colletotrichum was light and the structure was not clear (PAS ×400,bar=100 μm) F:After fluorescence staining,the hyphae of Colletotrichum had strong fluorescence,obvious and clear morphological characteristics (×400,bar=100 μm) G:After PAS staining,the hyphae staining of Aspergillus nidulans was light and the structure was not clear (PAS ×400,bar=100 μm) H:After fluorescence staining,the hyphae of Aspergillus nidulans had strong fluorescence,obvious and clear morphological characteristics (×400,bar=100 μm)

2.4 真菌與其他物質(zhì)的鑒別診斷

熒光染色液除與真菌細(xì)胞壁的成分結(jié)合生成復(fù)合物，在紫外激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光外，病變角膜組織中的炎癥細(xì)胞、變性的膠原纖維、活化的角膜基質(zhì)細(xì)胞以及切片上的雜質(zhì)均可與熒光染液結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)弱不等的熒光。角膜組織中浸潤的炎癥細(xì)胞需與念珠菌的孢子相鑒別，后者體積較大，一般在基質(zhì)層間成簇分布，產(chǎn)生的熒光比炎癥細(xì)胞強(qiáng)且孢子壁的熒光強(qiáng)于孢子中央，而炎癥細(xì)胞的表現(xiàn)卻相反，中間的細(xì)胞核呈現(xiàn)較明亮的熒光，細(xì)胞膜的熒光不明顯，結(jié)合常規(guī)蘇木精-伊紅染色則較容易識(shí)別炎癥細(xì)胞。感染性角膜組織基質(zhì)纖維變性、水腫、排列紊亂，此時(shí)變性的膠原纖維也可與熒光染液結(jié)合發(fā)出熒光，鏡下表現(xiàn)為異常彈性樣組織的圈狀或絲狀熒光，但此結(jié)構(gòu)為實(shí)心，未見分隔，與真菌呈中空的菌絲壁不同，而且比真菌菌絲細(xì)。角膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核呈長橢圓形，細(xì)胞質(zhì)少，常位于板層纖維間，與板層纖維平行排列，基質(zhì)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比真菌弱，對(duì)照常規(guī)蘇木精-伊紅染色切片容易區(qū)別。熒光染色制片過程中，可能混入棉絮或其他纖維性雜質(zhì)，此時(shí)雜質(zhì)與熒光染液結(jié)合常發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，亮度強(qiáng)于真菌菌絲，但根據(jù)熒光物質(zhì)的形態(tài)及其與組織標(biāo)本的關(guān)系一般可以做出判斷(圖3)。

圖3 真菌與其他物質(zhì)的鑒別診斷 A：角膜組織中浸潤的炎癥細(xì)胞(HE ×400，標(biāo)尺=100 μm) B：熒光染色可見炎癥細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)比較明亮的熒光，細(xì)胞膜的熒光不明顯(×400，標(biāo)尺=100 μm) C：念珠菌在角膜基質(zhì)間成簇分布，體積比炎癥細(xì)胞大(PAS ×400，標(biāo)尺=100 μm) D：熒光染色可見念珠菌的熒光比炎癥細(xì)胞強(qiáng)且孢子壁的熒光強(qiáng)于孢子中央(×400，標(biāo)尺=100 μm) E：變性的角膜基質(zhì)纖維，纖維排列紊亂(HE ×400，標(biāo)尺=100 μm) F：熒光染色可見變性的膠原纖維與熒光染液結(jié)合，鏡下表現(xiàn)為異常彈性樣組織的圈狀或絲狀熒光(×400，標(biāo)尺=100 μm) G：角膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核呈長橢圓形，細(xì)胞質(zhì)少(HE ×400，標(biāo)尺=100 μm) H：熒光染色可見基質(zhì)細(xì)胞熒光較真菌弱(×400，標(biāo)尺=100 μm) I：熒光染色可見制片過程中混入的纖維性雜質(zhì)，雜質(zhì)與熒光染液結(jié)合發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，亮度強(qiáng)于真菌菌絲(×200，標(biāo)尺=200 μm)Figure 3 Antidiastole of fungi and other substances A:Infiltrated inflammatory cells in corneal tissue (HE ×400,bar=100 μm) B:After fluorescence staining,the nucleus of inflammatory cells showed bright fluorescence,but the fluorescence of cell membrane was not obvious (×400,bar=100 μm) C:Candida showed cluster distribution among the corneal stroma,and the volume of Candida was larger than the inflammatory cells (PAS ×400,bar=100 μm) D:After fluorescence staining,the fluorescence of Candida was stronger than the inflammatory cells,and the fluorescence of the spore wall of Candida was stronger than that of spore centre (×400,bar=100 μm) E:Denatured corneal stroma fibers with a disordered fiber arrangement (HE ×400,bar=100 μm) F:After fluorescence staining,the denatured collagen fiber bounded to the fluorescence dye and appeared as abnormal elastic tissue with a circular or filamentous fluorescence under microscope (×400,bar=100 μm) G:The nucleus of corneal stroma cells was long oval and the cytoplasm was little (HE ×400,bar=100 μm) H:After fluorescence staining,the fluorescence of stroma cells was weaker than fungi (×400,bar=100 μm) I:After fluorescence staining,the fibrous impurities that mixed in the preparation process showed strong fluorescence after combination with the fluorescence dye,and the fluorescence was stronger than the fungal hyphae (×200,bar=200 μm)

3 討論

隨著FK臨床診療經(jīng)驗(yàn)的積累和實(shí)驗(yàn)室檢查技術(shù)的提高，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)有70多種真菌可引起角膜感染[4]，在不同國家及地區(qū)引起FK的菌種差別較大，氣候寒冷地區(qū)及發(fā)達(dá)國家以白念珠菌為主，氣候溫暖或炎熱地區(qū)及發(fā)展中國家以鐮刀菌和曲霉菌為主[5]。本研究中共有147例FK患者行真菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性119例，陽性率為81.0%，較常見的致病菌為黃曲霉復(fù)合群、茄病鐮刀菌復(fù)合群、層生鐮刀菌及鏈格孢霉，與以往報(bào)道基本一致[6]。

如何快速、準(zhǔn)確地診斷FK對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。角膜刮片氫氧化鉀(KOH)濕片檢查和真菌培養(yǎng)是較常用的實(shí)驗(yàn)室檢查方法，KOH濕片檢查方法簡單，通過刮取病變處角膜組織后滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的KOH溶解雜質(zhì)，于光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示陽性率為60.0%～81.0%[7-11]，但受限于角膜取材質(zhì)量及檢查人員的診斷水平，存在一定的假陰性結(jié)果，而且對(duì)于角膜移植術(shù)后復(fù)發(fā)的真菌性角膜感染，由于病灶位于角膜深層，表層刮片一般找不到真菌。真菌培養(yǎng)是診斷角膜真菌感染較可靠的方法，不僅可以明確真菌感染，還可以對(duì)菌種進(jìn)行鑒定和藥敏分析，但真菌培養(yǎng)的陽性率偏低，約為50%[12-14]，而且培養(yǎng)時(shí)間長。激光掃描共焦顯微鏡是一種無創(chuàng)性、高分辨率的活體檢查方法，其分辨率理論上可達(dá)1 μm，可以在細(xì)胞水平上對(duì)角膜進(jìn)行觀察，在診斷角膜疾病中得到廣泛應(yīng)用[15-16]，但是病變進(jìn)展以及抗真菌藥物的應(yīng)用可使菌絲變得不典型，從而影響診斷的準(zhǔn)確性。

病理檢查是疾病診斷的重要方法，組織病理學(xué)常規(guī)染色方法對(duì)真菌著色能力差，常難以分辨，在日常工作中常利用特殊染色來幫助識(shí)別真菌。過碘酸希夫染色是常用的特殊染色方法，其原理是過碘酸氧化真菌細(xì)胞壁上的多糖，使醛基游離，無色品紅可與游離的醛基結(jié)合生成復(fù)合物而被顯色。真菌熒光染色液利用特異性的熒光標(biāo)志物共價(jià)結(jié)合在β-糖苷基團(tuán)，形成β多糖-熒光素復(fù)合物并發(fā)出特異熒光[17]。真菌細(xì)胞壁所含的多糖類物質(zhì)，如幾丁質(zhì)和葡聚糖，是一類典型的β-型多糖，熒光素與真菌細(xì)胞壁的多糖特異性結(jié)合，形成強(qiáng)的熒光復(fù)合物，在熒光顯微鏡下觀察，可以清晰地顯示真菌的形態(tài)。本研究中所使用的真菌熒光染色液操作簡單、省時(shí)，石蠟組織標(biāo)本充分脫蠟后滴加1滴熒光染液，1 min后便可在熒光顯微鏡下觀察到染色結(jié)果。本研究中收集的147例真菌感染角膜組織分別行過碘酸希夫染色和熒光染色，結(jié)果顯示熒光染色法診斷FK的陽性率高于過碘酸希夫染色法，與閻艷等[18]的研究結(jié)果一致。真菌熒光染色法可以快速、準(zhǔn)確地診斷FK，對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。

真菌感染所致的角膜潰瘍由于菌絲侵犯角膜深度不同會(huì)采取不同的手術(shù)方式，本研究中根據(jù)不同手術(shù)方式分為PKP標(biāo)本、LKP標(biāo)本和病灶切除標(biāo)本。本研究結(jié)果顯示，不同手術(shù)方式切除的標(biāo)本應(yīng)用熒光染色更容易識(shí)別組織中的少量菌絲，染色后與背景對(duì)比鮮明，容易辨別，彌補(bǔ)了過碘酸希夫染色法在菌絲含量較少時(shí)敏感性低的不足。

過碘酸希夫染色法可以顯示大部分的真菌[19]，但是我們?cè)谌粘９ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)部分真菌會(huì)出現(xiàn)染色不良或者不著色的情況。本研究中真菌培養(yǎng)結(jié)果陽性者為119例，通過研究不同菌種過碘酸希夫染色和熒光染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茄病鐮刀菌復(fù)合群、譎詐腐霉、煙曲霉復(fù)合群、季也蒙假絲酵母、木霉和鋪葉沼蘭褐鶯真菌行熒光染色的陽性例數(shù)明顯高于過碘酸希夫染色，其中譎詐腐霉、季也蒙假絲酵母、木霉和鋪葉沼蘭褐鶯真菌過碘酸希夫染色均未檢出菌絲或孢子。本研究中譎詐腐霉所致的FK共5例，過碘酸希夫染色均未著色，可見較多平行于角膜基質(zhì)的圓形或長條形空隙，組織中較少見浸潤的炎癥細(xì)胞，熒光染色可顯示真菌的形態(tài)，但是菌絲的熒光較其他菌種弱，這可能與細(xì)胞壁中缺乏幾丁質(zhì)有關(guān)[20]。煙曲霉復(fù)合群、刺盤孢和構(gòu)巢曲霉行過碘酸希夫染色后雖然可以觀察到菌絲，但是菌絲染色較淡且結(jié)構(gòu)欠清晰，較易漏診，經(jīng)熒光染色后，菌絲熒光性強(qiáng)，形態(tài)特征明顯、清晰，不易漏診。由此可見，真菌熒光染色可彌補(bǔ)過碘酸希夫染色的不足，提高真菌的檢出率。但熒光染色液不僅可以與真菌細(xì)胞壁結(jié)合發(fā)出熒光，還可以與組織中的其他成分結(jié)合產(chǎn)生強(qiáng)弱不等的熒光，所以在診斷FK時(shí)需要仔細(xì)辨別，可以結(jié)合過碘酸希夫染色或蘇木精-伊紅染色結(jié)果綜合判斷分析。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示熒光染色診斷FK的敏感性高，特異性強(qiáng)，判斷直觀且操作簡便，對(duì)目前絕大多數(shù)FK致病菌種有良好的染色效果，熒光顯微鏡的普及可以使該方法得到進(jìn)一步的推廣。由于不同真菌菌株的標(biāo)本量有限，無法對(duì)不同真菌菌株標(biāo)本間2種染色的陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，后期還需增大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。熒光染色法對(duì)其他病原體感染導(dǎo)致的角膜炎是否有診斷價(jià)值仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突