趙 璽，李向宇，丁 銳，趙浩然，米叢波，吳曉琴

人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLF)是一個(gè)異質(zhì)性細(xì)胞群，參與牙周組織的改建和再生，hPDLF細(xì)胞在特定的刺激下，能夠促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，參與組織的修復(fù)和牙槽骨的改建[1-4]。亦有研究表明[5]，雌激素與其受體結(jié)合后能夠促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞在骨重建過(guò)程中核因子κB受體活化子配體及骨保護(hù)素的表達(dá)，進(jìn)而影響牙槽骨的重建。正畸治療時(shí)機(jī)械力作用于牙齒通過(guò)牙周膜傳遞至牙槽骨，繼而牙槽骨發(fā)生生物改建，包含了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化成熟[6-8]，所以，本文即探究聯(lián)合使用雌激素和機(jī)械治療能否影響hPDLF細(xì)胞的成骨分化及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

α-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；17β-雌二醇(美國(guó)Sigma公司)；cDNA合成試劑盒、qPCR檢測(cè)試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；茜素紅染色液(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物技術(shù)有限公司)；骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)、β雌激素受體(Estrogen Receptor-β, ER-β)、蛋白激酶B(protein kinases, Akt)、p-蛋白激酶B(p-protein kinases, p-Akt)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)一抗，山羊抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)X-5000T應(yīng)力加載系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó) FlexCell公司)。

1.2 人牙周膜成纖維細(xì)胞的分離與鑒定

收集健康正畸患者的健康前磨牙6顆，患者年齡18～25歲，征得患者的知情同意。取得患者前磨牙樣本后迅速轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌的PBS溶液沖洗3次，然后用無(wú)菌手術(shù)刀片刮取根中1/3區(qū)域的牙周膜組織，將組織轉(zhuǎn)移至α-MEM培養(yǎng)基中，使用無(wú)菌眼科剪將組織剪成1 mm3，研磨均勻，將牙周膜組織碎塊均勻放置在6孔板中，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率達(dá)80%時(shí)，使用0.25%的胰蛋白酶消化，傳代。提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測(cè)牙周膜成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白波形絲蛋白(Vimentin)和細(xì)胞角蛋白(CK)的表達(dá)。

1.3 細(xì)胞給藥及細(xì)胞加力

將分離的hPDLFs接種于6孔板中，分別加入17β-雌二醇使其終濃度為0、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，共孵育24 h后，使用MTT法檢測(cè)雌激素對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖能力的影響，以確定最佳給藥濃度，根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，設(shè)置細(xì)胞加力條件為：將細(xì)胞消化后，以1×108個(gè)/L分別接種于加力用細(xì)胞培養(yǎng)板中1/3部分，每板接種1 mL細(xì)胞懸液(即1×105個(gè)/板)，置于37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)。使用 FX-5000T 應(yīng)力加載系統(tǒng)分別刺激細(xì)胞12 h，振幅10%、頻率 0.5 Hz，每個(gè)循環(huán)中松弛和拉伸時(shí)間各1 s，按照上述處理方式，設(shè)置細(xì)胞分組為對(duì)照組、17β-雌二醇組、機(jī)械張力組、17β-雌二醇組聯(lián)合機(jī)械張力組。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取處理后的hPDLF細(xì)胞以4×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔200 μL，每組5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后每孔加 MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，去除孔內(nèi)的MTT溶液，每孔加DMSO 200 μL，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔的光密度值(OD值)，OD值越大，細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.5 茜素紅染色檢測(cè)hPDLF細(xì)胞成骨分化

配制成骨誘導(dǎo)液(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 mg/L維生素C，10 nmol/L地塞米松，10%胎牛血清，α-MEM培養(yǎng)基)，分別設(shè)置為對(duì)照組(成骨誘導(dǎo)液)、誘導(dǎo)17β-雌二醇組(成骨誘導(dǎo)液，1×10-7mol/L 17β-雌二醇)、誘導(dǎo)機(jī)械張力組(成骨誘導(dǎo)液，機(jī)械張力)、誘導(dǎo)17β-雌二醇+機(jī)械張力組(成骨誘導(dǎo)液，1×10-7mol/L 17β-雌二醇、機(jī)械張力)，培養(yǎng)細(xì)胞21 d，去除培養(yǎng)基后使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，加入茜素紅染液，37 ℃孵育15 min，棄茜素紅染液加入200 μL 10%氯化十六烷基吡啶溶解1 h，收集染色液，分光光度計(jì)590 nm處檢測(cè)光密度值(OD)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)成骨基因mRNA的表達(dá)

取各組處理后的hPDLF細(xì)胞，消化細(xì)胞至離心管中，加入Trizol裂解5 min，取上述細(xì)胞裂解液加入200 μL氯仿，靜置5 min后，于12 000×g，4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相，加入500 μL異丙醇，12 000×g，4 ℃離心10 min，去上清，1 mL 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μL RNA-free水重懸RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即為總RNA，使用核酸定量?jī)x檢測(cè)總RNA含量。根據(jù)cDNA Synthesis 試劑盒指示配置反應(yīng)體系，將提取的hPDLF細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后利用核酸定量?jī)x對(duì)cDNA進(jìn)行定量。然后根據(jù)qPCR試劑盒指示配置反應(yīng)體系，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，采用GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)后采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RUNX2、OCN、OSX、OPN、GAPDH引物序列Tab.1 RUNX2, OCN, OSX, OPN, GAPDH primer sequences

1.7 Western blot

取各組hPDLF細(xì)胞1×106個(gè)于離心管中，每管中加入500 μL的RIPA蛋白裂解液和5 μL的苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)蛋白酶抑制劑，于冰上充分裂解30 min，裂解液12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清，即為細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白定量后，各組蛋白加入上樣緩沖液后，沸水浴加熱變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對(duì)偏氟乙烯(polyvinglidene fluoride, PVDF)膜封閉2 h，然后以1∶1 000比例稀釋后的成骨相關(guān)蛋白OCN、OPN一抗，ER-β、Akt、p-Akt、GAPDH一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)多組間差異進(jìn)行單因素方差分析，行雙側(cè)檢測(cè)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hPDLF細(xì)胞鑒定結(jié)果

為鑒定提取到的hPDLF細(xì)胞，首先在顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖1A所示，所分離的hPDLF細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核呈圓形狀態(tài)，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后呈旋渦狀，符合hPDLF細(xì)胞的形態(tài)特征；Western blot鑒定hPDLF細(xì)胞標(biāo)志蛋白結(jié)果(圖1B)顯示，所分離的hPDLF細(xì)胞表達(dá)Vimentin和CK，證明本文從牙組織中提取到了hPDLF細(xì)胞，可用于后續(xù)研究。

A：hPDLF細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；B：Western blot檢測(cè)Vimentin和CK表達(dá)圖1 hPDLF細(xì)胞鑒定結(jié)果Fig.1 Results of hPDLF cell identification

2.2 17β-雌二醇對(duì)hPDLF細(xì)胞增殖能力的影響

為了驗(yàn)證17β-雌二醇對(duì)hPDLF細(xì)胞增殖能力的影響，分別用1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L 17β-雌二醇處理hPDLF細(xì)胞，并設(shè)置0 mol/L組作為空白對(duì)照，MTT檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L 17β-雌二醇處理hPDLF細(xì)胞后，各組hPDLF細(xì)胞的OD值均顯著高于對(duì)照組，1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L 17β-雌二醇組細(xì)胞OD值最大，細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，且給藥濃度超過(guò)1×10-7mol/L時(shí)，OD值無(wú)顯著增加，所以選擇1×10-7mol/L作為給藥濃度，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 雌激素聯(lián)合機(jī)械張力促進(jìn)hPDLF細(xì)胞的增殖能力

為了探究雌激素聯(lián)合機(jī)械張力對(duì)hPDLF細(xì)胞增殖能力的影響，將hPDLF細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)1×10-7mol/L 的17β-雌二醇、機(jī)械張力以及二者聯(lián)合處理后，MTT檢測(cè)增殖能力結(jié)果(圖3)顯示，17β-雌二醇、機(jī)械張力處理hPDLF細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖能力均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，而雌激素聯(lián)合機(jī)械張力組細(xì)胞增殖能力高于17β-雌二醇和機(jī)械張力單獨(dú)誘導(dǎo)組(P<0.001)，說(shuō)明雌激素聯(lián)合機(jī)械張力能夠顯著促進(jìn)hPDLF細(xì)胞的增殖能力。

與0 mol/L 17β-雌二醇組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001圖2 MTT法檢測(cè)17β-雌二醇對(duì)hPDLF細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 MTT method was used to detect the effect of 17β-estradiol on the proliferation of hPDLF cells

2.4 雌激素聯(lián)合機(jī)械張力促進(jìn)hPDLF細(xì)胞成骨基因的表達(dá)

為了探究雌激素聯(lián)合機(jī)械張力對(duì)hPDLF細(xì)胞成骨分化的影響，本文將hPDLF細(xì)胞經(jīng)過(guò)雌激素和機(jī)械張力的刺激后，檢測(cè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，qPCR結(jié)果(圖4)顯示，17β-雌二醇和機(jī)械張力單獨(dú)作用組hPDLF細(xì)胞成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN、OSX、OPN表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而17β-雌二醇聯(lián)合機(jī)械張力組細(xì)胞中RUNX2、OCN、OSX、OPN表達(dá)顯著高于17β-雌二醇和機(jī)械張力單獨(dú)作用(P<0.01)，說(shuō)明雌激素聯(lián)合機(jī)械張力促進(jìn)hPDLF細(xì)胞的成骨分化。

與對(duì)照組相比，*：P<0.05，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，###：P<0.001；與機(jī)械張力組相比，aaa：P<0.001圖3 MTT法檢測(cè)雌激素聯(lián)合機(jī)械張力對(duì)hPDLF細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 MTT method was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension on the proliferation ability of hPDLF cells

與對(duì)照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，##：P<0.01，###：P<0.001；與機(jī)械張力組相比，aa：P<0.01，aaa：P<0.001圖4 qPCR檢測(cè)雌激素聯(lián)合機(jī)械張力促進(jìn)hPDLF細(xì)胞對(duì)成骨基因的表達(dá)的影響Fig.4 qPCR detection of the effect of estrogen combined with mechanical tension to promote hPDLF cells on the expression of osteogenic genes

2.5 雌激素聯(lián)合機(jī)械張力促進(jìn)hPDLF細(xì)胞成骨分化

茜素紅染色檢測(cè)雌激素和機(jī)械張力對(duì)hPDLF細(xì)胞成骨分化的影響，結(jié)果(圖5)顯示，17β-雌二醇和機(jī)械張力單獨(dú)作用組hPDLF細(xì)胞茜素紅OD值顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；17β-雌二醇聯(lián)合機(jī)械張力組茜素紅OD值顯著高于17β-雌二醇和械張力單獨(dú)作用組(P<0.001)；說(shuō)明雌激素聯(lián)合機(jī)械張力可顯著促進(jìn)hPDLF細(xì)胞的成骨分化。

與對(duì)照組相比， **：P<0.01，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，###：P<0.001；與機(jī)械張力組相比，aaa：P<0.001圖5 茜素紅染色檢測(cè)雌激素和機(jī)械張力對(duì)hPDLF細(xì)胞成骨分化的影響Fig.5 Alizarin red staining was used to detect the effect of estrogen and mechanical tension on osteogenic differentiation of hPDLF cells

2.6 雌激素聯(lián)合機(jī)械張力促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白OCN、OPN表達(dá)及ER-β表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖6)顯示，經(jīng)過(guò)17β-雌二醇和機(jī)械張力作用后，成骨相關(guān)蛋白OCN、OPN表達(dá)顯著增加(P<0.01)，雌激素受體ER-β表達(dá)顯著增加(P<0.05)，17β-雌二醇和機(jī)械張力聯(lián)合作用后，hPDLF細(xì)胞中OCN、OPN表達(dá)顯著增加(P<0.001)，ER-β表達(dá)亦顯著增加(P<0.001)，說(shuō)明雌激素聯(lián)合機(jī)械張力能夠促進(jìn)hPDLF細(xì)胞成骨分化，及上調(diào)雌激素受體ER-β的表達(dá)。

2.7 雌激素聯(lián)合機(jī)械張力促進(jìn)Akt信號(hào)通路的激活

Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖7)顯示，相比于對(duì)照組，17β-雌二醇組、機(jī)械張力組hPDLF細(xì)胞p-Akt磷酸化水平顯著增加(P<0.01)；而17β-雌二醇組+機(jī)械張力組hPDLF細(xì)胞p-Akt磷酸化水平均顯著高于17β-雌二醇組和機(jī)械張力組(P<0.001)，說(shuō)明雌激素聯(lián)合機(jī)械張力能夠顯著促進(jìn)Akt信號(hào)通路的激活。

3 討 論

hPDLF細(xì)胞是牙周膜中的主要細(xì)胞，在牙周疾病、正畸等治療中，hPDLF的成骨分化功能發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。已有研究表明，雌激素可影響hPDLF細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)其成骨分化以及骨重建[10]。同時(shí)，hPDLF細(xì)胞是一種對(duì)應(yīng)力敏感的細(xì)胞，受到機(jī)械應(yīng)力后，將力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯蛏硇盘?hào)，細(xì)胞骨架蛋白是最直接的外力感受器，調(diào)節(jié)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10-14]。在正畸治療中，機(jī)械張力發(fā)揮主要的治療作用，研究表明，在機(jī)械張力作用下， hPDLF細(xì)胞具有最佳的增長(zhǎng)活力[15]。本研究就主要探究了在雌激素和機(jī)械張力的聯(lián)合作用下，hPDLF成骨分化的變化及機(jī)制。

與對(duì)照組相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，###：P<0.001；與機(jī)械張力組相比，aaa：P<0.001)圖6 Western blot檢測(cè)雌激素聯(lián)合機(jī)械張力對(duì)OCN、OPN、ER-β表達(dá)的影響Fig.6 Western blot was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension on the expression of OCN, OPN, ER-β

與對(duì)照組相比，**：P<0.01，***：P<0.001；與17β-雌二醇組相比，###：P<0.001；與機(jī)械張力組相比，aaa：P<0.001)圖7 Western blot檢測(cè)雌激素聯(lián)合機(jī)械張力對(duì)Akt信號(hào)通路的影響Fig.7 Western blot was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension on the Akt signaling pathway

本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素聯(lián)合機(jī)械張力誘導(dǎo)后，hPDLF細(xì)胞的增殖能力顯著高于雌激素單獨(dú)作用和機(jī)械張力單獨(dú)作用組細(xì)胞的增殖能力，并且茜素紅染色結(jié)果顯示，雌激素聯(lián)合機(jī)械張力誘導(dǎo)后hPDLF細(xì)胞的成骨分化水平亦顯著增加，說(shuō)明雌激素聯(lián)合機(jī)械張力能夠促進(jìn)hPDLF細(xì)胞的成骨分化，提示雌激素聯(lián)合機(jī)械張力或許可以用于口腔疾病的治療，以提高治療效果。

接下來(lái)，本文即探究了其發(fā)揮促成骨分化的作用的機(jī)制，RUNX2、OCN、OPN、OSX是hPDLF細(xì)胞成骨分化的標(biāo)志蛋白，可作為評(píng)價(jià)hPDLF細(xì)胞成骨分化的標(biāo)志物，本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素聯(lián)合機(jī)械張力誘導(dǎo)hPDLF細(xì)胞后RUNX2、OCN、OPN、OSX表達(dá)顯著增加，說(shuō)明雌激素聯(lián)合機(jī)械張力可促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮促分化的作用，并且雌激素聯(lián)合機(jī)械張力誘導(dǎo)后雌激素受體ER-β表達(dá)亦增加，說(shuō)明二者聯(lián)合使用可通過(guò)上調(diào)ER-β表達(dá)而促進(jìn)雌激素發(fā)揮功能。

PI3K/Akt信號(hào)通路的激活是通過(guò)Akt的磷酸化實(shí)現(xiàn)，活化的Akt通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游一系列底物，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等[16-18]。并且已經(jīng)有研究表明，rhBMP9 作用于 hPDLF后可通影響PI3K/AKT 信號(hào)通路而調(diào)控成骨分化[19-20]，所以本文亦研究了雌激素聯(lián)合機(jī)械張力對(duì)hPDLF細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示，激素聯(lián)合機(jī)械張力能夠顯著激活PI3K/Akt信號(hào)通路。

綜上所述，雌激素聯(lián)合機(jī)械張力能夠促進(jìn)hPDLF細(xì)胞的成骨分化，上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)雌激素受體ER-β表達(dá)，以及激活PI3K/Akt信號(hào)通路，但其精細(xì)機(jī)制及臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。