李志超，張廣昊，黃 雁，陳 明

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連 116034)

0 引 言

脂糖肽抗生素A40926是抗感染新藥Dalvance的合成前體[1-2]，由野野村放線菌(Nonomuraeasp.)ATCC 39727代謝生成[3-4]。A40926為A0、A1、B0、B1等組分構(gòu)成的復(fù)合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)上與替考拉寧相似，均含有交聯(lián)七肽骨架、兩個氯原子、一個甘露糖和一個脂酰氨基葡萄糖酸，但各組分連接的疏水脂酰側(cè)鏈不同[5-6]。研究表明，脂酰側(cè)鏈能大大提高A40926的抑菌活性[7]。

然而，A40926生物合成基因簇中并不含合成脂酰側(cè)鏈的基因[8]。Beltramatti和Jovetic等[9-10]研究了培養(yǎng)基中添加支鏈氨基酸對野野村放線菌細(xì)胞脂肪酸和A40926各組分比例的影響，發(fā)現(xiàn)A40926各組分比例與生產(chǎn)菌細(xì)胞脂肪酸組成在變化趨勢上存在一致性，推測細(xì)胞脂肪酸經(jīng)β-氧化后生成A40926的脂酰側(cè)鏈，而支鏈氨基酸則作為細(xì)胞脂肪酸合成的前體物。

Wallace等[11]研究了3種放線菌細(xì)胞直鏈、支鏈脂肪酸生物合成的起始物，認(rèn)為放線菌支鏈脂肪酸的生物合成以異丁酰CoA(對應(yīng)生成偶數(shù)碳的iso-脂肪酸)、3-甲基丁酰CoA(對應(yīng)生成奇數(shù)碳的iso-脂肪酸)、2-甲基丁酰CoA(對應(yīng)生成奇數(shù)碳的anteiso-脂肪酸)為合成起始物，直鏈脂肪酸的合成以丁酰CoA(對應(yīng)生成偶數(shù)碳的n-脂肪酸)、丙酰CoA(對應(yīng)生成奇數(shù)碳的n-脂肪酸)為合成起始物。Nonomuraeasp.ATCC 39727作為一種新發(fā)現(xiàn)的放線菌，對其生物特性研究較少[12]。本實驗對該菌利用短鏈羧酸合成細(xì)胞脂肪酸進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

Nonomuraeasp.ATCC 39727，實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基ISP2(g/L)：葡萄糖4.0，酵母提取物4.0，麥芽提取物10.0，瓊脂20.0，pH 7.0。

培養(yǎng)基P150(g/L)：葡萄糖20，(NH4)2SO43.65，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.45，CaCO35，每升加入3 mL微量元素液(g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5，CuSO4·5H2O 0.39，ZnSO4·7H2O 0.44，MnSO4·H2O 0.15，CuCl20.02，NaMoO4·2H2O 0.011，50 mL 37% HCl)。

培養(yǎng)基P150中分別添加短鏈羧酸(丙酸、丁酸、異丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸)，質(zhì)量濃度0.3 g/L。

1.1.3 試劑與儀器

三氟化硼-甲醇，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；丙酸、丁酸、異丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、甲醇、正己烷，均為分析純。

氣質(zhì)聯(lián)用儀，Agilent Technologies GC-MS 7890/5795。

1.2 方 法

1.2.1 菌體培養(yǎng)

取-80 ℃冰箱中甘油管菌種，涂布至培養(yǎng)基ISP2平板，28 ℃培養(yǎng)7～8 d，挑取單菌落至裝有2 mL無菌水的試管中，加入幾粒玻璃珠，對菌體進(jìn)行振蕩破碎，取1 mL菌懸液接入25 mL合成培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h。

1.2.2 細(xì)胞脂肪酸的甲酯化及組分的GC-MS分析

方法見參考文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基P150中菌體細(xì)胞脂肪酸組成

菌體經(jīng)合成培養(yǎng)基P150培養(yǎng)后，對菌體的細(xì)胞脂肪酸組成進(jìn)行GC-MS分析，圖1為培養(yǎng)基P150培養(yǎng)菌體細(xì)胞脂肪酸的總離子色譜圖。結(jié)果表明，共檢出9種主要脂肪酸，以偶數(shù)碳直鏈脂肪酸為主，C16：0脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(22.08%)，C14：0、C16：1、C16：0、C18：0 4種偶數(shù)碳直鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總脂肪酸的47.76%；偶數(shù)碳支鏈脂肪酸i-C16：0質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)21.89%，i-C14：0和i-C16：0兩種脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)27.04%；奇數(shù)碳的i-C15：0、C15：0、a-C17：0脂肪酸同時被檢出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

圖1 培養(yǎng)基P150中細(xì)胞脂肪酸總離子色譜圖Fig.1 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150

表1 菌體細(xì)胞脂肪酸組成Tab.1 Cell fatty acids composition of Nonomuraea sp.ATCC 39727 %

2.2 添加丙酸對菌體細(xì)胞脂肪酸組成的影響

圖2為合成培養(yǎng)基P150添加0.3 g/L丙酸后菌體細(xì)胞脂肪酸的總離子色譜圖。與圖1相比，添加丙酸后細(xì)胞脂肪酸組成發(fā)生了很大變化，奇數(shù)碳直鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，其中C15：0 脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原來的5.96%增加到19.64%，原來未檢出C17：0脂肪酸，后達(dá)6.86%(表1)，這可能是丙酰CoA為奇數(shù)碳直鏈脂肪酸合成起始物所致；添加丙酸后，C14：0、C16：1、C16：0等偶數(shù)碳直鏈脂肪酸及anteiso-C17：0脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，但C18：0脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅度增加。

圖2 添加丙酸菌體的脂肪酸總離子色譜圖Fig.2 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150 supplemented with propionic acid

2.3 添加丁酸對菌體細(xì)胞脂肪酸組成的影響

圖3為合成培養(yǎng)基P150添加0.3 g/L丁酸后菌體細(xì)胞脂肪酸的總離子色譜圖。與圖1相比，添加丁酸后細(xì)胞脂肪酸組成變化不大，添加丁酸后，C16：0脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，C18：0脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，C14：0、C16：1、C16：0、C18：0等4種偶數(shù)碳直鏈脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的50.70%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大(見表1)，說明添加丁酸對偶數(shù)碳直鏈脂肪酸的合成起始物丁酰CoA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響并不大。

圖3 添加丁酸菌體脂肪酸總離子色譜圖Fig.3 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150 supplemented with butyric acid

2.4 添加異丁酸對菌體細(xì)胞脂肪酸組成的影響

圖4為合成培養(yǎng)基P150添加0.3 g/L異丁酸后菌體細(xì)胞脂肪酸的總離子色譜圖。與圖1相比，添加異丁酸后細(xì)胞脂肪酸組成發(fā)生了很大變化，偶數(shù)碳支鏈脂肪酸i-C16：0質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，為質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的脂肪酸，同時C16：0脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降(表1)。異丁酰CoA為i-C16：0 脂肪酸合成起始物，異丁酸的添加導(dǎo)致了i-C16：0脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的顯著增加，同時導(dǎo)致偶數(shù)碳直鏈脂肪酸C16：0質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。

圖4 添加異丁酸菌體脂肪酸總離子色譜圖Fig.4 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150 supplemented with isobutyric acid

2.5 添加3-甲基丁酸對菌體細(xì)胞脂肪酸組成的影響

圖5為合成培養(yǎng)基P150添加0.3 g/L 3-甲基丁酸后菌體細(xì)胞脂肪酸的總離子色譜圖。與圖1相比，添加3-甲基丁酸后細(xì)胞脂肪酸組成變化不大。3-甲基丁酰CoA為奇數(shù)碳iso-脂肪酸的合成起始物，添加3-甲基丁酸后i-C15：0脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增幅很小(表1)，推測是Nonomuraeasp.ATCC 39727利用3-甲基丁酰CoA為脂肪酸合成起始物的能力較差所致。

圖5 添加3-甲基丁酸菌體脂肪酸總離子色譜圖Fig.5 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150 supplemented with 3-methylbutyric acid

2.6 添加2-甲基丁酸對菌體細(xì)胞脂肪酸組成的影響

圖6為合成培養(yǎng)基P150添加0.3 g/L 2-甲基丁酸后菌體細(xì)胞脂肪酸的總離子色譜圖。2-甲基丁酰CoA為奇數(shù)碳anteiso-脂肪酸的合成起始物，但添加2-甲基丁酸卻導(dǎo)致a-C17：0脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低(表1)，因此Nonomuraeasp.ATCC 39727體內(nèi)anteiso-脂肪酸的合成還需要進(jìn)一步的研究。

圖6 添加2-甲基丁酸菌體脂肪酸總離子色譜圖Fig.6 FAME GC-MS profile of Nonomuraea sp.ATCC 39727 cells grown in medium P150 supplemented with 2-methylbutyric acid

3 結(jié) 論

對脂糖肽抗生素A40926產(chǎn)生菌Nonomuraeasp.ATCC 39727利用短鏈羧酸合成細(xì)胞脂肪酸的能力進(jìn)行了研究。該菌優(yōu)先利用異丁酰CoA、丁酰CoA和丙酰CoA為細(xì)胞脂肪酸合成起始物，但利用3-甲基丁酰CoA為脂肪酸合成起始物的能力較差。