操 強，胡 巍，高金燕，陳紅兵，佟 平

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330047；3.南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

雞蛋是常見八大食物過敏原之一[1]，雞蛋過敏原蛋白主要存在于蛋清中，其中卵白蛋白（ovalbumin，OVA）占蛋清中蛋白含量的54%[2]，是雞蛋中過敏原蛋白含量最高的一種蛋白質(zhì)。過敏原的抗體結合表位是過敏原蛋白上可被機體識別并產(chǎn)生一系列免疫反應的位點，一般分為線性表位[3]和構象表位[4]。因此，在脫敏/低致敏蛋制品研究領域，研究人員常采用一些加工手段對過敏原的線性表位和構象性表位進行改造以達到降低/完全消除致敏性的目的[5]。

近年有較多活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究，活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用一方面可提高活性物質(zhì)的吸收率、生物利用率[6]，另一方面改善蛋白質(zhì)的加工特性[7-8]、潛在致敏性[9]?，F(xiàn)有研究表明多酚類物質(zhì)可與花生蛋白、牛奶蛋白等過敏原蛋白相互作用，蛋白質(zhì)的氨基酸微環(huán)境、高級結構（二、三、四級結構）都可能受到影響，從而改變過敏原蛋白的線性表位、構象表位，起到降低過敏原蛋白致敏性的作用[10-11]。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種非黃酮類多酚化合物，具有抗腫瘤[12]、保護心血管[13]、抑菌[14]、抗氧化[15]、抗炎癥[16]、免疫調(diào)節(jié)[17]等生物活性。研究顯示RES可以抑制IgE介導的皮膚過敏反應的發(fā)生/減緩癥狀[18]，另有實驗結果表明RES作為膳食補充劑可以預防食物過敏的發(fā)生[19]。而RES作為膳食補充劑與雞蛋中主要過敏原OVA的相互作用及其對OVA潛在致敏性產(chǎn)生的影響仍不清楚，需要進一步的研究闡明。

本研究以RES和OVA為研究對象，利用熒光光譜法探究OVA和RES相互作用的機理，且從體外血清學角度評價OVA-RES復合物的潛在致敏性。本研究旨在指導開發(fā)具有豐富活性且低致敏或脫敏的蛋制品，為人們的日常健康膳食提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅殼雞蛋 市場；RES（純度＞99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；OVA（純度＞95%）由實驗室自制；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS） 北京索萊寶科技有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗、羊抗人免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）二抗 美國Sigma公司；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色液、鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）結合物 深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；PB-10酸度計 賽多利斯科學儀器有限公司；F-4600熒光分光光度計 日本日立高新技術公司；Lambda 25紫外-可見分光光度計 珀金埃爾默儀器有限公司；MOS-450圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光猝滅光譜

在298、306、314 K三種溫度條件下進行熒光猝滅實驗，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度固定為2.5 nm，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長范圍250～500 nm，掃描速率為1 200 nm/min。首先向石英比色皿加入3 mL 2h 10-6mol/L的OVA溶液（0.01 mol/L pH 7.4 PBS配制），恒溫穩(wěn)定5 min后掃描熒光光譜，然后再依次加入6 μL 2h 10-3mol/L RES溶液（含20%乙醇，以PBS配制），一共滴加10 次，每次滴加后移液槍吹打混勻，恒溫靜置3 min后掃描熒光光譜。此外掃描PBS熒光光譜以及相應濃度RES溶液激發(fā)波長、發(fā)射波長處的紫外-可見光吸收光譜，分別用于緩沖液背景校正和內(nèi)濾光校正[20]。

1.3.2 同步熒光光譜

298 K條件下，設置激發(fā)波長和發(fā)射波長間距分別為15 nm（Δλ=15 nm，Tyr）和60 nm（Δλ=60 nm，Trp），掃描2h 10-6mol/L OVA溶液同步熒光光譜，再分別滴加5 次RES溶液，12 μL/次，每次混勻靜置3 min后再掃描。

1.3.3 三維熒光光譜

在298 K條件下，激發(fā)波長范圍200～400 nm（每5 nm），發(fā)射波長范圍200～600 nm（每5 nm），OVA和OVA-RES以物質(zhì)的量比為1∶1、1∶2的OVA-RES（1∶1）、OVA-RES（1∶2）溶液分別進行三維熒光光譜掃描。

1.3.4 ANS熒光光譜

將OVA溶液和0.01 mol/L PBS配制的ANS按OVA-RES物質(zhì)的量比分別為4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4混合，渦旋混勻，避光反應1 h。激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為400～450 nm，狹縫寬度5.0 nm，電壓為700 V，掃描樣品的ANS熒光光譜。

1.3.5 圓二色譜

以OVA計算，將樣品稀釋成0.1 mg/mL，遠紫外圓二色譜的條件：光徑1 mm，掃描范圍190～250 nm，速率60 nm/min，帶寬1 nm，超純水作為空白對照。通過在線圓二色譜分析網(wǎng)站（http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/ho.shtml）對數(shù)據(jù)進行分析計算，結果以平均摩爾橢圓率表示，單位為（degg cm2）/dmol。

1.3.6 潛在致敏性

1.3.6.1 體外IgG結合能力

間接競爭法評估體外IgG結合能力，取A板4 ℃過夜包被抗原（OVA），用含體積分數(shù)0.05%吐溫20的PBS（即PBST）洗滌后，再用3 g/100 mL的脫脂乳在37 ℃條件下孵育封阻1 h。另取B板用脫脂乳37 ℃封阻1 h后，PBST洗滌后再加入50 μL競爭蛋白與50 μL用PBS稀釋50 000 倍的兔血清IgG（一抗）溶液進行反應。競爭反應：B板中的競爭蛋白與稀釋的一抗板外反應l h后，從B板將相應孔中的反應液轉移至A板，設置陰性孔（PBS代替競爭蛋白和抗血清）、陽性孔（PBS代替競爭蛋白），37 ℃孵育1 h后洗滌，每孔加入100 μL稀釋好的HRP標記的羊抗兔IgG（二抗，1∶5 000），37 ℃孵育1 h后。競爭反應結束后洗滌扣干，然后每孔加100 μL TMB顯色液，37 ℃孵育15 min，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4溶液終止反應，在450 nm波長處檢測OD450nm。以抑制率表示IgG結合能力，抑制率計算見式（1）：

1.3.6.2 體外IgE結合能力

同1.3.6.1節(jié)先取A板進行包被抗原，PBST洗滌后脫脂乳封阻1 h。另外取B板脫脂乳37 ℃封阻1 h，洗滌后加入競爭抗原和60 μL稀釋的人血清（一抗，1∶20），37 ℃孵育反應1 h。競爭反應：取出A板洗板后，吸取100 μL B板的反應液轉入A板中，37 ℃孵育1 h后洗滌，然后加入100 μL生物素標記的羊抗人IgE（二抗，1∶5 000），37 ℃孵育1 h。競爭反應結束后洗滌扣干，每孔加入100 μL HRP標記的鏈霉親和素（1∶60），再次37 ℃孵育1 h后洗滌，每孔加入100 μL的TMB顯色液，37 ℃反應15 min后再每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4溶液終止顯色反應，測定OD450nm。IgE抑制率計算同式（1）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 相互作用機理

蛋白質(zhì)的色氨酸（tryptophan，Trp）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）等氨基酸可以在一定波長的激發(fā)光下產(chǎn)生內(nèi)源性熒光，氨基酸殘基的熒光強弱變化和最大熒光強度波長的變化可以表征蛋白質(zhì)構象的變化，因此常用熒光光譜法研究蛋白質(zhì)的結構[21]。如圖1A～C所示，在298、306、314 K條件下，固定激發(fā)波長280 nm，隨著RES的加入，OVA的熒光強度有明顯減弱，且各溫度下都表現(xiàn)出不同程度的紅移現(xiàn)象。這可能是OVA被激發(fā)后處于激發(fā)態(tài)時與RES碰撞，這種相互碰撞導致激發(fā)態(tài)分子的能量轉移和喪失，蛋白質(zhì)恢復基態(tài)從而表現(xiàn)為熒光猝滅的現(xiàn)象，而溫度的變化使得分子的熱運動速率不同，碰撞頻率也不一樣[21]。由此可得RES和OVA發(fā)生了相互作用，RES的加入使得蛋白質(zhì)的Trp等殘基微環(huán)境發(fā)生了改變。

圖1 RES對OVA的熒光猝滅影響Fig.1 Effects of RES on fluorescence spectra of OVA at different temperatures

圖1D中3 條曲線分別是298、306、314 K條件下，以RES濃度為橫坐標、F0/F為縱坐標擬合的Stern-Volmer曲線，方程[22]如下：

式中：F0和F為無猝滅劑和有猝滅劑時的熒光強度；[Q]為猝滅劑濃度/（μmol/L）；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)/（L/（molg s））；Kq為生物分子猝滅速率常數(shù)/（L/mol）；τ0為無猝滅劑的生物大分子平均壽命（τ0=10-8s）[23]。

熒光猝滅類型一般分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，由圖1D可知，猝滅曲線和RES濃度有良好的線性關系，而且Stern-Vlomer斜率隨著溫度升高而增大，即猝滅常數(shù)KSV隨溫度升高而增大，由此可以判斷RES對OVA的熒光猝滅類型為分子間碰撞而引起的動態(tài)猝滅。

RES相對分子質(zhì)量為228.24，是一種多酚類小分子物質(zhì)。小分子物質(zhì)在與生物大分子蛋白質(zhì)相互作用時，可能存在一個平衡狀態(tài)，即部分小分子與蛋白結合，而另一部分處于游離狀態(tài)，因此通過如下雙對數(shù)方程描述這種平衡關系[24]：

式中：Ka為RES與OVA的結合常數(shù)/（L/mol）；n為結合位點數(shù)。

表1 不同溫度下OVA-RES的熒光猝滅常數(shù)KSV、猝滅速率常數(shù)Kq、結合常數(shù)Ka、結合位點數(shù)n及熱力學參數(shù)Table 1 Quenching constants (KSV), binding constants (Ka), and relative thermodynamic parameters for the interaction between RES and OVA at different temperatures

從表1可知，298、306、314 K條件下，OVA-RES的結合常數(shù)分別為1.53h 104、0.55h 104、0.20h 104L/mol，而結合位點數(shù)分別為0.964 8、0.820 3、0.739 7，說明RES與OVA結合的最佳比例約為1∶1。

此外，研究小分子物質(zhì)和大分子蛋白質(zhì)相互作用常涉及對相互作用的熱力學參數(shù)的計算，以解析相互作用過程中作用力類型為主導，研究常用范特霍夫方程計算焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和吉布斯自由能變（ΔG）等相關信息[25]。范特霍夫方程如下：

Ross等[26]總結出依據(jù)相互作用過程中由焓、熵、吉布斯自由能的數(shù)值可推知相互作用力的類型。其中，ΔS＞0、ΔH＞0為典型的疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0主要存在氫鍵和范德華力；ΔH＜0、ΔS＞0時，主要存在靜電相互作用。經(jīng)計算RES和OVA相互作用熱力學參數(shù)信息如表1所示，ΔH＜0，ΔS＜0，可以確定RES與OVA的相互作用力主要是氫鍵和范德華力，該結果與另一類似研究結果相同[27]。這可能與RES含有多個酚羥基有關，酚羥基是較強的極性基團，可與側鏈帶羥基的氨基酸（例如絲氨酸、蘇氨酸）形成氫鍵，而OVA中絲氨酸和蘇氨酸數(shù)量之和占全蛋白氨基酸總數(shù)的13.73%[28]。

2.2 同步熒光光譜

在Δλ=1 5 n m 和Δλ=6 0 n m 時O VA 的 同 步 熒 光光 譜，分 別 表 示R E S 對O VA 的T y r 和T r p 殘 基 微環(huán)境的影響。從圖2可知，熒光強度都隨著RES濃度增大而減小，其中Δλ=15 nm時，熒光光譜表明RES對OVA的Tyr殘基的吸收峰最佳吸收波長有所影響，發(fā)生了明顯藍移，從原來的297 nm變?yōu)?96 nm，這可能是因為RES的添加導致Tyr所處微環(huán)境的極性減小[29]；當RES添加量達到3.92 μmol/L時，最強吸收峰值強度變化為20.78%，這表示蛋白質(zhì)構象可能發(fā)生了明顯變化；而Δλ=60 nm時，光譜顯示最佳吸收波長無明顯移動，RES對OVA中Trp微環(huán)境影響較Tyr的弱，當RES添加量為3.92 μmol/L時，熒光最強吸收峰值熒光強度變化為13.65%。此外，因為RES的添加對Tyr和Trp的微環(huán)境影響不一，這說明RES與OVA相互作用時，RES與兩種氨基酸的作用距離可能有所不同[30]。

圖2 298 K條件下Δλ=15 nm（A）和Δλ=60 nm（B）時OVA的同步熒光光譜Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of OVA in the absence and presence of RES at Δλ = 15 nm (A) and Δλ = 60 nm (B)

2.3 三維熒光光譜

圖3 OVA的三維熒光光譜（A、B、C）和外源性熒光光譜（D）Fig.3 3D fluorescence spectra (A, B, C) and changes in ANS-fluorescence (D)intensity of OVA and OVA-RES at different ratios

表2 OVA、OVA-RES的三維熒光光譜峰位置和峰高Table 2 Three-dimensional fluorescence parameters of OVA and OVA-RES at different ratios

從圖3和表2可知，RES對OVA的三維熒光光譜熒光強度有所影響，其中峰a是Trp和Tyr的特征峰，在三維熒光光譜中表征蛋白質(zhì)的三級結構，而峰b表征的是蛋白質(zhì)的多肽鏈骨架，即二級結構[31]。隨著RES的添加，OVA的峰a的峰高明顯降低，峰高從原來的876.8減小為805.6和745.1，但是峰位置無明顯變化，然而表征二級結構的峰b的峰高、峰位置皆有變化，峰b從原來的（230 nm/335 nm）紅移為（235 nm/340 nm），以上信息都表明RES對OVA的氨基酸微環(huán)境、蛋白構象有影響，而且從結果看這種相互作用對OVA的二級結構影響更大[32]。

2.4 表面疏水性

從圖3D可知，在實驗設計的配比范圍內(nèi)，OVA-RES以1∶1物質(zhì)的量比復合時，RES對OVA的表面疏水性影響最大，且RES導致OVA的表面疏水性增加，其最高吸收峰峰高變化為4.65%（P＜0.05）。可能是因為RES作為小分子化合物可以進入OVA內(nèi)部與之相互作用，從而影響到OVA的疏水性空腔，使得內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露在蛋白質(zhì)的表面。OVA-RES物質(zhì)的量比為2∶1對OVA表面疏水性的影響程度與1∶2相當，且都不如物質(zhì)的量比為1∶1影響大?？傊趯嶒炈O計比例范圍中，OVA-RES物質(zhì)的量比為1∶1是最佳比例，因此后續(xù)的實驗以1∶1為OVA-RES復合物配比。

2.5 圓二色譜

在光譜中α-螺旋構象在222、208 nm波長處呈負峰，190 nm附近有一個正峰，且峰強度表示結構含量的多少；β-折疊構象在215 nm波長處有一個負峰，在185～200 nm波長處有一較強的正峰[33]。由圖4可知，OVA二級結構受到RES的干擾，OVA-RES在190、208 nm和222 nm附近的峰強絕對值較OVA都有所增加，即RES使得OVA的α-螺旋含量增加。復合物和單一蛋白的二級結構含量雖然無顯著差異（P＞0.05），但是變化主要發(fā)生在α-螺旋和β-折疊結構上，而OVA過敏原表位的氨基酸殘基組成50%以上是疏水性氨基酸，且主要處于α結構和β結構上面[6]，結合表面疏水性結果分析，RES可能是通過氫鍵、范德華力與OVA相互作用促使疏水性氨基酸環(huán)境改變，從而影響到OVA的二級結構。

圖4 RES對OVA二級結構的影響Fig.4 Effect of RES on secondary structures of OVA

2.6 潛在致敏性

圖5 OVA-RES相互作用對OVA體外IgG（A）和IgE（B）結合能力的影響Fig.5 IgG (A) and IgE (B) binding abilities of OVA and OVA-RES

OVA和RES以物質(zhì)的量比1∶1進行復合，利用進行間接競爭ELISA法測定OVA、OVA-RES的IgG、IgE結合能力，結果以抑制率表示。IC50值越大，樣品與IgE的結合能力越弱。從圖5可知，RES的加入導致OVA的IC50值顯著變?。≒＜0.05），即RES與OVA相互作用導致OVA與IgG、IgE結合能力變強，即潛在致敏性顯著增強。該結果與Shi Xiaolei等[34]的不同，可能是因為文獻中的實驗對象是動物，橘皮素在其中不僅影響過敏原蛋白的結合位點，而更重要的是橘皮素本身就有較好免疫調(diào)節(jié)的生物活性，這在其他研究中已有證明[35]。水溶性極差的RES與OVA相互作用，促使蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸暴露在蛋白質(zhì)表面，蛋白質(zhì)結構相對展開，內(nèi)部的IgG、IgE結合位點更多地暴露在表面，表面可及性提升，使得OVA的潛在致敏性增強[6]。

3 結 論

本研究以RES和OVA為研究對象，利用熒光光譜法、圓二色譜法探究OVA-RES復合物相互作用的機理，且從體外血清學角度評價OVA-RES復合物的潛在致敏性。RES通過動態(tài)猝滅方式猝滅OVA的內(nèi)源性熒光，兩者最佳復合比為物質(zhì)的量比1∶1，兩者相互作用的主要作用力是氫鍵、范德華力，屬于ΔG＜0的自發(fā)過程。另外同步熒光、三維熒光、外源性熒光、圓二色譜結果都表明RES可引起OVA氨基酸殘基微環(huán)境和構象的變化。OVA-RES相互作用導致蛋白質(zhì)疏水性增加、結構展開，并且可增強OVA的IgG、IgE結合能力，即RES可能會增強OVA的潛在致敏性，這可能與相互作用導致結構展開后暴露更多的過敏原表位有關。