趙文華，李富祥，楊仕標(biāo)

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650224）

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）是一種以被感染動(dòng)物發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎為臨床特征的亞急性或急性烈性動(dòng)物傳染病，其致病病原體是副黏病毒科的小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）。小反芻獸疫因快速傳播和較高的病死率，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，在我國為一類動(dòng)物疫病[1-2]。2007年7月我國在西藏阿里地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)小反芻獸疫疫情[3]。2013年底PPR再次沿河西走廊從新疆向全國范圍快速傳播，至今仍有零星散發(fā)[4-5]。PPR已成為嚴(yán)重威脅我國畜牧業(yè)生產(chǎn)安全的動(dòng)物疫病之一。

裂谷熱（rift valley fever，RVF）是一種由蚊子傳播的人、畜共患疾病，其致病病原體是布尼亞病毒科白蛉病毒屬的裂谷熱病毒（rift Valley fever virus，RVFV），該病嚴(yán)重威脅人、畜健康[1,6]。最易感染RVF的宿主動(dòng)物是綿羊、山羊、羔羊、牛、老鼠和一些野生動(dòng)物。RVF最早于30年代初在肯尼亞東部裂谷省因?qū)е赂腥狙虻母吡鳟a(chǎn)率而被發(fā)現(xiàn)報(bào)道。近年來，已有30多個(gè)國家發(fā)現(xiàn)RVF，大部分位于非洲[7-8]。中國首例RVFV輸入性人感染病例于2016年6月確診，該病對(duì)我國也存在很大的威脅[9-10]。裂谷熱已被OIE列為必須報(bào)告的疫病。目前，我國尚無動(dòng)物感染該病的報(bào)道。

施馬倫貝格病毒（schmallenberg virus，SBV）是一種正布尼亞病毒，于2011年11月在德國通過宏基因組檢測首次被發(fā)現(xiàn)，此后在歐洲迅速傳播[11-12]。SBV由庫蠓傳播，多種家畜和野生動(dòng)物均易感染。感染的牛、羊會(huì)發(fā)熱、腹瀉、產(chǎn)奶量減少流產(chǎn)、后代畸形。2013年9月下旬，共有27個(gè)歐洲國家被認(rèn)為是SBV感染區(qū)。2016～2017年，英國和法國仍然在爆發(fā)施馬倫貝格?。⊿B）[13]。目前，我國尚無該病的報(bào)道。

PPR、RVF和SB是牛、羊等反芻動(dòng)物重要的外來動(dòng)物疫病。為了有效地防控3種外來動(dòng)物疫病入侵，在邊境地區(qū)外來動(dòng)物疫病日常監(jiān)測、海關(guān)進(jìn)口活體牛、羊及其制品檢驗(yàn)檢疫中，需要對(duì)3種病原實(shí)施檢測。

上述3種病毒均為RNA病毒，本研究通過設(shè)計(jì)、篩選不同引物及探針配對(duì)組合,優(yōu)化反應(yīng)條件，初步建立起PPRV、RVFV、SBV三重常規(guī)RT-PCR及實(shí)時(shí)熒光三聯(lián)定量RT-PCR檢測技術(shù)，以期能實(shí)現(xiàn)同步快速檢測3種病毒并可鑒別診斷，從而提高疫病檢測效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 陽性樣本

PPRV-M陽性pMDTM18-T質(zhì)粒樣本為本實(shí)驗(yàn)室先前課題研究制備；RVFV-S片段陽性pMDTM18-T質(zhì)粒樣本為委托寶生物工程（大連）有限公司人工合成；SBV-S片段陽性pMDTM18-T質(zhì)粒樣本為昆明海關(guān)技術(shù)中心艾軍博士饋贈(zèng)；PPRV疫苗株為本課題組貯存；羊痘、羊口瘡、口蹄疫、阿卡斑、藍(lán)舌病及鹿流行性出血熱等陽性病料為本實(shí)驗(yàn)室貯存。

1.1.2 臨床樣本

620份PPRV抗體陽性樣本采自云南不同地區(qū)，258份鼻拭子及血凝塊樣本隨機(jī)采自昆明轄區(qū)某大型牲畜交易市場及某規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場，47份野生及家養(yǎng)野生動(dòng)物拭子樣本或新鮮糞便樣本采自迪慶藏族自治州。

1.1.3 引物及探針

根據(jù)參考文獻(xiàn)[14-15]及GenBank相關(guān)序列，設(shè)計(jì)相關(guān)病毒檢測引物及探針見表1和表2。

HPLC級(jí)探針及引物均由大連寶生物公司合成。用無RNAase酶的PCR級(jí)水將引物/探針干粉進(jìn)行溶解，制備貯存引物/探針濃度為100μm/L、工作濃度為10μm/L探針、引物工作濃度為20μm/L。

表1 PPRV、RVFV、SBV三重常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增引物情況Tab.1 Primers of triplex routine RT-PCR for Amplification of PPRV,RVFV,SBV

表2 PPRV、RVFV、SBV三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增探針引物情況Tab.2 Probes and Primers of triplex real-time RT-PCR for detection of PPRV/RVFV/SBV

1.1.4 試劑、耗材及儀器設(shè)備

試劑盒耗材：0.85%無菌生理鹽水為實(shí)驗(yàn)室配制，用于采集鼻拭子樣本及樣本浸泡；病毒核酸（DNA/RNA）的抽提用TaKaRa MiniBest Viral RNA/DNA Extraction kit；質(zhì)粒樣品的抽提用TaKaRa MiniBest Plasmid Purification Kit（9760）；普通PCR擴(kuò)增用TaKaRa Ex Taq（RR001A）；普通RT-PCR擴(kuò) 增 用TaKaRa One Step RNA PCR Kit（RR024A）；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR所用試劑盒為One Step PrimeScript TM RT-PCR（Perfect Real Time，RR064A）；DNA片段膠回收選用型號(hào)為9762的TaKaRa MiniBest Agarose Gel DNA抽提試劑盒；T載體構(gòu)建用pMDTM18-T Vector Cloning試劑盒；Marker DL2000、核酸染色劑GoldviewII分別為分子量標(biāo)記和染色劑，上述試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

儀器設(shè)備：ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀、熒光定量PCR反應(yīng)管、GeneAmp PCR SYSTEM 9700普通PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；用于核酸定量測定的Nanovue Plus微量分光光度儀為GE公司產(chǎn)品；Blowest Agarose瓊脂糖購自上海生工公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒基因組DNA、RNA提取

采集的鼻拭子樣本加入5～8 mL生理鹽水浸泡過夜，各取200μL待用。采集的血液樣本，取凝結(jié)后的血塊加適量生理鹽水研磨各取200μL待用。血清樣本直接取200μL備用。然后按照試劑盒說明書提取病毒基因組DNA/RNA。

1.2.2 反應(yīng)體系與反應(yīng)程序

PPRV/RVFV/SBV三重常規(guī)RT-PCR反應(yīng)液配制50μL。反應(yīng)體系：10×One Step RNA PCR buffer 5.0μL、MgCI210.0μL、dNTP Mixture 5.0μL、RNase Inhibitor 1.0μL、AMV Reverse Transcriptase XL 1.0μL、AMVOptimized Taq 1.0μL、Primer PPR-M2F 1.0μL、Primer PPRV-M2R 1.0μL、Primer RVFV-NP2F 1.0μL、Primer RVFV-NP2R 1.0μL、Primer SBV-NP1F 1.0μL、Primer SBV-NP1R 1.0μL、質(zhì)粒DNA（樣品RNA或陽性對(duì)照RNA、陰性對(duì)照H2O）2.0μL、PCR級(jí)H2O 19.0μL。將上述各反應(yīng)組分加入PCR反應(yīng)管混勻，在ABI 9700普通PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序：42℃、30 min，95℃、2 min，35×（94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min)，72℃、10 min。反應(yīng)完成后取適量反應(yīng)液跑2.5%瓊脂糖凝膠，然后于紫外成像儀上檢測擴(kuò)增結(jié)果。

PPRV/RVFV/SBV三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)液配制20μL。反應(yīng)體系：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10.0μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.4μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL、RoxⅡ0.4μL、Primer PPRV-MtryF1 0.2μL、Primer PPRV-M-tryR1 0.2μL、PPRVProbe-M 0.4μL、Primer RVFV-tryF1 0.2μL、Primer RVFV-tryR1 0.2μL、RVFV-Probe1 0.4μL、Primer SBVtryF1 0.2μL、Primer SBV-tryR1 0.2μL、SBV-Probe1 0.4μL、樣品RNA 6.0μL（或PPRV、RVFV、SBV陽性對(duì)照質(zhì)粒DNA各2.0μL、陰性對(duì)照H2O 6.0μL）、PCR級(jí)H2O 0.4μL。將上述各反應(yīng)組分加入PCR反應(yīng)管并振蕩混勻，在7500 Fast熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)和熒光信號(hào)的檢測，反應(yīng)程序：42℃、5 min，95℃、20 s，43×（95℃、5 s，60℃、35 s)。熒光信號(hào)檢測在每個(gè)循環(huán)反應(yīng)的60℃進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPRV、RVFV、SBV三重普通常規(guī)RT-PCR方法的建立（見圖1～圖3）

經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)組合，最后篩選出PPRV-M2F/R、RVFVNP2F/R、SBV-NP1F/R引物對(duì)組合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)PPRV、RVFV、SBV的特異性三重普通RT-PCR檢測。當(dāng)將3種引物對(duì)同時(shí)加入反應(yīng)體系中時(shí)，同時(shí)存在3種病毒質(zhì)粒DNA時(shí)有3條預(yù)期條帶擴(kuò)增出，分別是RVFV的558 bp條帶、PPRV的460 bp條帶和SBV的381 bp條帶。由圖1可知，加入兩兩組合的病毒質(zhì)粒DNA有對(duì)應(yīng)的2種特異片段；而僅有一種病毒質(zhì)粒DNA存在時(shí)，只有一條特異條帶。由圖2、圖3可知，三重常規(guī)RT-PCR對(duì)臨床相似病毒羊痘、羊口瘡、口蹄疫、阿卡斑、藍(lán)舌病及鹿流行性出血熱等病毒未有擴(kuò)增，檢測敏感度可達(dá)103copies/μL DNA。最優(yōu)反應(yīng)條件為：42℃、30 min，95℃、2 min，35×（94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min)，72℃、10 min。

圖1 PPRV-M2、RVFV-NP2、SBV-NP1引物對(duì)組合三重常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of triplex routine RT-PCR amplified with PPRV-M2,RVFV-NP2,SBV-NP1 primer sets

圖2 PPRV-M2、RVFV-NP2、SBV-NP1引物對(duì)組合三重常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensibility test of the triplex routine PCR for PPRV-M2,RVFV-NP2,SBV-NP1 primer sets

圖3 PPRV-M2、RVFV-NP2、SBV-NP1引物對(duì)組合三重常規(guī)RT-PCR特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test of the triplex routine RT-PCR for PPRV-M2,RVFV-NP2,SBV-NP1 primer sets

2.2 PPRV、RVFV、SBV三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的建立

以上述已經(jīng)構(gòu)建好的PPRV-M、RVFV-NP、SBV-NP的pMDTM-18T載體質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分別10倍系列稀制備109copies/μL～100copies/μL的質(zhì)粒模板，然后按照最優(yōu)反應(yīng)條件用表2所示探針和配套引物對(duì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增，依據(jù)擴(kuò)增曲線進(jìn)行PPRV-RVFV-SBV三聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，見圖4。由圖4可知，在102～107copies/μL濃度之間各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)與Ct值之間存在良好的線性關(guān)系，PPRV-M-Cy5探針標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式：Y=-3.399 639X+39.519020，R2=0.9991擴(kuò)增效率為96.86%；RVFV-NP-FAM探針標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式：Y=-3.122288X+41.300 491，R2=0.999 1，擴(kuò)增效率為109.06%；SBV-NP-VIC探針標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式：Y=-3.482 866X+42.405 140，R2=0.999 1，擴(kuò)增效率為93.70%。上述方程式中Y為Ct值，X為拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)（Log copy number），R2表示相關(guān)系數(shù)。

圖4 PPRV、RVFV、SBV三重?zé)晒舛縍T-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of PPRV,RVFV,SBV triplex real-time RT-PCR

不同稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)梯度擴(kuò)增曲線，見圖5～圖7。由圖5～圖7可知，若以Ct值35為陽性樣品臨界值來計(jì)算，則PPRV-M-Cy5探針的樣本理論上的檢測敏感性可低至101.33copies/μL，SBV-NP-VIC探針對(duì)樣本的理論檢測敏感度可達(dá)102.13copies/μL，RVFV-NP-FAM探針對(duì)樣本的理論檢測敏感度可達(dá)102.02copies/μL；較普通常規(guī)RT-PCR的敏感性均高近10倍。以優(yōu)化的反應(yīng)條件選取104、105、106、107copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板分別連續(xù)擴(kuò)增3次進(jìn)行熒光信號(hào)的檢測，檢測結(jié)果顯示PPRV、RVFV、SBV每個(gè)梯度的樣本重復(fù)性均很好。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見表3。由表3可知，組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中變異系數(shù)均小于2.5%，表明所構(gòu)建的方法具有較好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

圖5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品PPRV-M動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線Fig.5 Dynamic curve of PPRV-M standard plasmid

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒RVFV-NP動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線Fig.6 Dynamic curve of RVFV-NP standard plasmid

圖7 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒SBV-NP動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線Fig.7 Dynamic curve of SBV-NP standard plasmid

2.3 三重實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法特異性測定及其初步臨床應(yīng)用（見圖8）

用上述已經(jīng)建立的PPRV、RVFV、SBV三重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量RT-PCR方法對(duì)620份PPRV抗體陽性血清樣本、258份鼻拭子和血凝塊樣本及47份野生動(dòng)物拭子樣本或新鮮糞便樣本，抽提DNA、RNA后進(jìn)行檢測。

由圖8可知，上述樣本中均未檢測到RVFV及SBV核酸陽性樣本，在鼻拭子樣本中檢測出一例羊PPRV核酸陽性樣本（該陽性樣本經(jīng)普通RT-PCR擴(kuò)增和序列測定Blast比對(duì)后確定為PPRV譜系IV型）。

表3 PPRV、RVFV、SBV三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性試驗(yàn)Tab.3 Repeatability test of triplex real-time RT-PCR for PPRV,RVFV,SBV standard plasmids

圖8 臨床樣本PPRV、RVFV、SBV三重?zé)晒舛縍T-PCR特異性檢測熒光曲線Fig.8 Fluorescence curve of PPRV,RVFV,SBV triple fluorescencequantitative RT-PCR in clinical samples

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR/RT-PCR一種快速定性并可定量的新型檢測技術(shù)。檢測儀器的熒光檢測一般有4個(gè)通道，第1通道檢測波長為515～530 nm，可用熒光素及染料為FAM、SYBR Green I；第2通道檢測波長為560～580 nm，可用熒光素及染料為VIC、HEX、JOE、TAMRA、TET或Cy3；第3通道檢測波長為610～650 nm，可用熒光素及染料為ROX、TEXAS-Red；第4通道檢測波長為675～730 nm，可用熒光素及染料為Cy5。選用不同檢測通道的標(biāo)記物對(duì)探針進(jìn)行差異熒光標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)兩病或更多病的同步快速檢測。

本實(shí)驗(yàn)室所用的ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀，因?yàn)檫x擇“ROX”染料作為背景參照，所以對(duì)于該儀器來說是不能選擇第3通道的熒光染料來標(biāo)記探針的，該儀器最多只能同時(shí)進(jìn)行三聯(lián)探針的檢測。本研究即通過用“Cy5-BHQ2”、“FAM-TAMRA”及“VIC-BHQ1”分 別 標(biāo) 記PPRV-M探針、RVFV-NS探針及SBV-NP探針，來實(shí)現(xiàn)對(duì)PPRV、RVFV及SBV的同步三重快速檢測。

三重反應(yīng)時(shí)較單獨(dú)反應(yīng)會(huì)有競爭試劑的些許相互影響，即擴(kuò)增效率較單獨(dú)擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)有些許的變化，但這在大規(guī)模檢測時(shí)會(huì)大大降低診斷、檢測試劑成本，較適合高通量檢測。

本研究所建立的PPRV、RVFV、SBV三聯(lián)探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法可特異性地對(duì)PPRV、RVFV和SBV進(jìn)行同步快速檢測，現(xiàn)已經(jīng)進(jìn)行初步的臨床應(yīng)用，但仍需進(jìn)行大批量臨床樣本的驗(yàn)證和進(jìn)一步的優(yōu)化。而本研究中所的構(gòu)建PPRV、RVFV、SBV的特異性三重普通常規(guī)RT-PCR檢測方法，亦可實(shí)現(xiàn)對(duì)該三種病毒的同步檢測，具有一般PCR儀的普通基層實(shí)驗(yàn)室即可推廣使用。

4 結(jié)論

本研究初步建立可同步特異性檢測PPRV、RVFV和SBV的三重普通RT-PCR方法和三重實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法，并進(jìn)行初步臨床應(yīng)用。PPRV、RVFV、SBV三重普通RT-PCR方法檢測敏感度可達(dá)103copies/μL DNA；PPRV、RVFV、SBV三重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測敏感度可達(dá)101.33～102.13copies/μL DNA。PPRV、RVFV、SBV三重普通常規(guī)RT-PCR檢測方法及三聯(lián)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法為PPRV、RVFV和SBV的高通量快速檢測以及鑒別診斷提供參考。