祿曉艷 楊金草

甘肅省甘南藏族自治州藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 甘南 74700

石榴日輪丸為常用藏藥制劑(藏文讀音:索吉尼美吉廊日布)，由石榴子、冬葵果、肉桂、天門(mén)冬、黃精、西藏棱 子芹、蓽茇、喜瑪拉雅紫茉莉、紅花、蒺藜、豆蔻等 11 味藥材組成，具有溫補(bǔ)胃腎的功能,用于消化不良、腰腿冷痛、小便頻數(shù)、腳背浮腫、陽(yáng)痿、遺精等，是治療胃、腎性病癥的常用藥之一，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥第一冊(cè)[1]，但標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下只有顯微鑒別和丸劑的常規(guī)檢驗(yàn)，沒(méi)有薄層鑒別和含量測(cè)定。方中石榴子及其活性成分鞣花酸均具有抗 癌、抗痢疾性腹瀉、抗氧化、降血糖和雌激素樣等藥理作用[2-3]；蓽茇屬溫里藥，具有溫中散寒、行氣止痛之功效，臨床適用于胃脘冷痛、胃寒嘔吐或泄瀉[4]，其主要活性成分胡椒堿具有催眠、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗抑郁和骨骼肌松弛等作用臨床主要用于胃痛、腹瀉等[5]；紅花為活血化瘀的經(jīng)典中藥之一，其有效成分羥基紅花黃色素A具有活血化瘀、抗炎、抗腫瘤等作用[6-7]。為了進(jìn)一步控制該藥品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法(TLC)對(duì)石榴子、紅花進(jìn)行定性鑒別[8]，用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定該制劑中蓽茇的有效成分胡椒堿含量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 G7111A四元泵，Agilent 1260 G7115A二極管陣列檢測(cè)器,Agilent 1260 G7129A自動(dòng)進(jìn)樣器(內(nèi)置柱溫箱)；BT224S、CP-225D電子天平；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器；CAMAG WFH-201BJ薄層呈像系統(tǒng)(半自動(dòng)點(diǎn)樣儀及數(shù)碼成像系統(tǒng))。

1.2 試藥 胡椒堿對(duì)照品(批號(hào)：110775-201706，供含量測(cè)定用，純度 98.9%)；石榴子對(duì)照藥材(121431-201002，供薄層鑒別用)；紅花對(duì)照藥材(120907-201713，供薄層鑒別用)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，默克公司)；水為超純水，其余試劑均為分析純；硅膠GF254薄層板、高效硅膠H薄層板(青島海洋化工廠)；石榴日輪丸由甘南藏族自治州碌曲縣西倉(cāng)寺院藏醫(yī)院(批號(hào)：190324、190502、190711、191006、191102)提供。

2 薄層鑒別試驗(yàn)

2.1 石榴子TLC鑒別 取本品3批各1 g，加乙醇5 mL，超聲處理30 min，取上清液作為供試品溶液；另取石榴子對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取缺石榴子的陰性對(duì)照1 g同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述供試品及陰性對(duì)照溶液各10 μL，對(duì)照藥材溶液3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照無(wú)干擾，如圖1所示。

2.2 紅花TLC鑒別 取本品3批各1 g，加80%丙酮溶液5 mL，密塞，振搖15 min，靜置，取上清液作為供試品溶液；另取紅花對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取缺紅花的陰性對(duì)照 1 g 同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述供試品、陰性對(duì)照溶液及對(duì)照藥材溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照無(wú)干擾，如圖2所示。

3 胡椒堿含量測(cè)定

3.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 試驗(yàn)色譜柱選用CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.06% 磷酸溶液(70∶30)；檢測(cè)波長(zhǎng)：343 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：對(duì)照品10 μL，供試品：5 μL；理論板數(shù)按胡椒堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 取胡椒堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含胡椒堿0.2124 mg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取供試品5 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，放置過(guò)夜，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按供試品的處方和制法，制成不含蓽茇的陰性樣品，按“3.3”項(xiàng)下的方法制得陰性對(duì)照溶液。

3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取蓽茇陰性對(duì)照溶液、空白溶劑(甲醇)及流動(dòng)相各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。結(jié)果：在蓽茇陰性對(duì)照溶液、空白溶劑(甲醇)及流動(dòng)相色譜圖中，在與蓽茇對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間點(diǎn)，未見(jiàn)有色譜峰。結(jié)論：陰性無(wú)干擾，本品其他藥材、溶劑及輔料不干擾本品的胡椒堿含量測(cè)定，基線完全分離，且峰形良好，本方法的專屬性很好，如圖3所示。

3.6 線性關(guān)糸考察 分別精密吸取胡椒堿對(duì)照品溶液(濃度為0.2124mg·mL-1)4、6、8、10、12、15 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值：以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，分別作圖，得胡椒堿的線性回歸方程為：Y=8526.85X-29.1158，r=0.9999；結(jié)果表明，胡椒堿在0.850～3.186 μg之間線性關(guān)系良好。

3.7 儀器精密度試驗(yàn) 取胡椒堿同一濃度對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定胡椒堿峰面積，RSD為0.25%，表明儀器的精密度良好。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一樣品(批號(hào)：190324)按“3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析，測(cè)定含量，結(jié)果胡椒堿的RSD為0.47%。

3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液并于供試品溶液制備后2、4、6、8、12、24 h，分別進(jìn)樣1次，測(cè)定峰面積值以考慮溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果在24 h內(nèi)，供試品溶液中胡椒堿峰面積穩(wěn)定，RSD為0.55%(n=6)，供試品溶液在24 h分析時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的石榴日輪丸供試品(批號(hào)：190324)0.5 g，精密稱定6份，分3組，每組2份，分別按樣品中胡椒堿含有量與相應(yīng)對(duì)照品加入量的比例約為1∶0.8、1∶1、1∶1.2，加入胡椒堿對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.2124 mg·mL-1)6.25、7.80、9.35 mL，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 胡椒堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

3.11 樣品的含量測(cè)定 取5批石榴日輪丸，按“3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液。分別進(jìn)樣，測(cè)得峰面積積分值，計(jì)算石榴日輪丸中胡椒堿的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 石榴日輪丸中胡椒堿的測(cè)定結(jié)果 (n=3，mg·g-1)

結(jié)果表明：5批石榴日輪丸指標(biāo)性成分胡椒堿含量差異較小，考慮到原料含量的差異、在生產(chǎn)過(guò)程中的損失以及試驗(yàn)操作過(guò)程中的誤差，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，轉(zhuǎn)移率按80%計(jì)算，并綜合考慮單味藥蓽茇的含量限度，建議本品胡椒堿的含量限度為：本品每1 g含胡椒堿(C17H19NO3)，不得少于2.0 mg。

4 討論

4.1 石榴子的薄層條件選擇 在石榴子的薄層鑒別中，比較了乙酸乙酯加熱回流提取和乙醇超聲提取，環(huán)已烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶12∶3)和石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)展開(kāi)系統(tǒng)，硅膠G薄層板和硅膠GF254薄層板。結(jié)果表明，加熱回流和超聲提取效果基本一致，故選用簡(jiǎn)便、快速的超聲提取，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)展開(kāi)劑展開(kāi)，斑點(diǎn)清晰。

4.2 紅花的薄層條件選擇 在紅花的薄層鑒別中，分別對(duì)硅膠G薄層板、硅膠H薄層板及高效硅膠H薄層板(展開(kāi)劑：乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇7∶2∶3∶0.4)進(jìn)行薄層色譜分析，結(jié)果以高效硅膠H板結(jié)果斑點(diǎn)清晰，分離度好，Rf值適中。

4.3 胡椒堿的流動(dòng)相選擇 在流動(dòng)相的優(yōu)化中，參照文獻(xiàn)[9-12]，比較甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，胡椒堿的分離效果。結(jié)果表明，甲醇-0.1磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，胡椒堿出峰時(shí)間較早，能夠獲得較好的分離效果，峰形對(duì)稱性較好，該方法專屬性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性、相關(guān)性好，可用于石榴日輪丸的質(zhì)量控制。

4.4 方法比較 根據(jù)科技查新報(bào)告，有關(guān)藏藥石榴日輪丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面，國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)四川大學(xué)華西藥學(xué)院王曙的“藏藥石榴日輪丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”[8]，研究者對(duì)石榴日輪丸進(jìn)行了薄層色譜鑒別和薄層掃描含量測(cè)定研究，本研究在其研究基礎(chǔ)上增加了石榴子的薄層色譜研究，并將胡椒堿的含量測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)。