許炎坤， 陶宏兵， 劉永龍， 周 剛， 黃小茉,3*

1.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663； 2.廣東省防霉抗菌工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070； 3.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室，廣東 廣州 510070

水性工業(yè)產(chǎn)品中的日化用品、涂料及膠粘劑已成為現(xiàn)代發(fā)展的主流工業(yè)行業(yè)。隨著現(xiàn)代經(jīng)濟發(fā)展水平的提高，人們對日化用品的需求越來越大，越來越多的生物活性原料被應(yīng)用到日化用品中，但是由于這些原料中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)如脂類、醇、水溶性高聚物、蛋白質(zhì)等，為微生物的生長與繁殖提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)來源，日化用品生產(chǎn)工藝也較簡單，一般沒有像食品藥品一樣經(jīng)過嚴格的滅菌或除菌工藝，且經(jīng)常需要重復(fù)使用，因此較容易受微生物污染而腐敗變質(zhì)，變質(zhì)后產(chǎn)品可能發(fā)生變色、變味甚至產(chǎn)生微生物毒素，危害人體健康[1-3]。對于涂料及膠粘劑而言， 其中含有微生物生長所需的大量有機物、高分子材料和水等營養(yǎng)物質(zhì)，只要溫度適宜就會進行生長繁殖，如果不對微生物進行抑制，可能會出現(xiàn)一系列問題如分散劑被分解、顏料漿的黏度增加、pH降低等，一些厭氧微生物還會引起亮度降低、產(chǎn)生硫化氫氣味等，最終破壞產(chǎn)品性能和損害其商品使用的價值，給企業(yè)和廠家造成經(jīng)濟損失[4，5]。因此，研究日化用品、涂料及膠粘劑中微生物的種屬分布情況、分析常見優(yōu)勢菌的耐藥性及構(gòu)建好的防腐體系顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 樣品來源和種類

2019年從全國各地采集到的各種變質(zhì)水性工業(yè)產(chǎn)品，包括日化用品變質(zhì)樣(洗潔精、洗發(fā)水、沐浴露等)、涂料及膠粘劑變質(zhì)樣(乳膠漆、膠水、膩子膏等)。

1.2 培養(yǎng)基

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、MH瓊脂培養(yǎng)基，常規(guī)生化的試驗所用的培養(yǎng)基參照《微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用》[6]。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸桿菌(ATCC8099)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、銅綠假單胞菌(ATCC9027)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC10031)、枯草芽孢桿菌(ATCC9372)、洋蔥伯克霍爾德氏菌(ATCC25416)。

1.4 殺菌防腐劑

卡松、布羅波爾(BP)、甲基異噻唑啉酮(MIT)、苯并異噻唑啉酮(BIT)，均由廣東迪美生物技術(shù)有限公司提供。

1.5 檢測方法

1.5.1菌株分離方法

根據(jù)樣品性狀和腐敗程度，將樣品用無菌生理鹽水進行一系列梯度稀釋后，分別取100 μL涂布至TSA和PDA培養(yǎng)基表面進行培養(yǎng)。對于細菌，挑取形態(tài)不同的單菌落進行劃線分離，然后用甘油管進行菌種保存，對于真菌，挑取孢子用平板純化培養(yǎng)，然后用斜面保存菌種。

1.5.2菌株形態(tài)及生理生化鑒定

按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]、《真菌鑒定手冊》[8]和細菌、真菌的培養(yǎng)特征對菌株進行初步鑒定。

1.5.3菌株分子生物學(xué)鑒定

依據(jù)《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》[9]中的方法分別提取細菌和真菌的總DNA，利用16S rDNA和18S rDNA通用引物分別對細菌和真菌進行PCR序列擴增。細菌通用引物序列為：F27: 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’；R1492: 5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。細菌PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 15 min。真菌通用引物序列為：F: 5’-CCAGTAGTCATATGCTTGTCT-3’；R:5’-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3’。真菌PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 15 min。經(jīng)測序得到拼接序列后到NCBI上進行Nucleotide BLAST比對分析。

1.5.4腐敗細菌的耐藥性實驗

1.5.4.1 耐藥性濃度標(biāo)準(zhǔn)

配制卡松、BP、MIT和BIT四種殺菌防腐劑，初濃度均分別為50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg和500 mg/kg，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、枯草芽孢桿菌和洋蔥伯克霍爾德氏菌作為耐藥性標(biāo)準(zhǔn)，按照消毒技術(shù)規(guī)范(2002年版)的瓊脂法最小抑菌濃度實驗標(biāo)準(zhǔn)，將滅好菌的MH瓊脂培養(yǎng)基與各濃度防腐劑以9∶1形式加到無菌培養(yǎng)皿并混合搖勻(10倍稀釋得到終濃度5 mg/kg、10 mg/kg、15mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg和50 mg/kg)，同時設(shè)無防腐劑的培養(yǎng)基作為陽性對照，吸取已制備好的107CFU/mL菌懸液2 μL點種至培養(yǎng)基上。

1.5.4.2 變質(zhì)樣中腐敗細菌的耐藥性

以1.5.4.1的實驗結(jié)果確定四種殺菌防腐劑對6種標(biāo)準(zhǔn)菌的最低抑菌濃度，以每種防腐劑對6種標(biāo)準(zhǔn)菌最小抑菌濃度中的最大濃度作為該防腐劑的耐藥性標(biāo)準(zhǔn)。同樣按照消毒技術(shù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，對所有變質(zhì)樣腐敗細菌進行單一耐藥性標(biāo)準(zhǔn)濃度測試，分析其耐藥性是否大于標(biāo)準(zhǔn)菌耐藥性濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 變質(zhì)樣中微生物的分布情況

從收集的變質(zhì)樣中共分離出微生物625株，其中細菌584株，占微生物總數(shù)的93.44%；真菌42株，占微生物總數(shù)的6.72%。微生物的分布情況如表1所示。由表1可以看出，涂料及膠粘劑微生物污染較為嚴重，占了總數(shù)的64.80%；兩種污染樣中細菌的比重均遠大于真菌。

表1 變質(zhì)樣中腐敗微生物的分布情況

2.2 變質(zhì)樣中微生物的種屬分布

從日化用品變質(zhì)樣中共分離出220株微生物，其中革蘭氏陽性細菌有37株，占比為16.82%；革蘭氏陰性細菌有176株，占比為80.00%；真菌只有7株，占比為3.18%。由此看出其污染的微生物主要為革蘭氏陰性細菌，微生物的種屬分布情況如表2所示。分離的革蘭氏陽性細菌中芽孢桿菌屬的數(shù)量最多(蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌)，占比為11.36%，其中，蠟樣芽孢桿菌為主要的芽孢桿菌優(yōu)勢菌群；而革蘭氏陰性細菌中克雷伯氏菌屬(肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、變棲克雷伯氏菌)、假單胞菌屬(類產(chǎn)堿假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、氧化吲哚假單胞菌)和伯克霍爾德氏菌屬(洋蔥伯克霍爾德氏菌、新洋蔥伯克霍爾德氏菌)所占的比重較大，占比分別為21.36%、24.06%和10.00%，肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、類產(chǎn)堿假單胞菌、銅綠假單胞菌和洋蔥伯克霍爾德氏菌是主要的革蘭氏陰性細菌。

表2 日化用品變質(zhì)樣中微生物的種屬分布

從涂料及膠粘劑變質(zhì)樣中共分離出405株微生物，革蘭氏陽性細菌有155株，占比為38.27%，革蘭氏陰性細菌有216株，占比為53.33%；真菌有34株，占比為8.40%。其微生物種屬分布如表3所示。其中，分離的革蘭氏陽性細菌主要為芽孢桿菌屬，總共有75株，占比為18.52%，包含的物種主要有貝萊斯芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌；而分離的革蘭氏陰性細菌主要為假單胞菌屬，總共92株，占比為22.72%，包含的物種主要有銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、殺香魚假單胞菌、門多薩假單胞菌、氧化吲哚假單胞菌和施氏假單胞菌，其次為固氮菌屬細菌且均為圓褐固氮菌，含有32株，占比為7.90%；優(yōu)勢真菌主要為曲霉屬和鐮孢菌屬。

表3 涂料及膠粘劑變質(zhì)樣中微生物的種屬分布

2.3 變質(zhì)樣中腐敗細菌的耐藥性情況

經(jīng)實驗確定20 mg/kg卡松、50 mg/kg BP、20 mg/kg MIT和15 mg/kg BIT能穩(wěn)定保證6種標(biāo)準(zhǔn)菌均不生長，為該殺菌防腐劑對6種標(biāo)準(zhǔn)細菌菌株的最小抑菌濃度(MIC)，因此將其作為本研究的耐藥性標(biāo)準(zhǔn)。

從變質(zhì)樣中共分離出584株細菌，日化細菌213株，涂料及膠粘劑細菌371株，這些細菌對特定濃度卡松、BP、MIT和BIT耐藥性分布情況如表4所示。由表可得，四種殺菌防腐劑中，對MIT和BIT產(chǎn)生耐藥性的細菌最多，占比分別為33.22%和35.45%，而卡松和BP耐藥性菌株比例較小(6.68%和11.13%)。

表4 變質(zhì)樣中腐敗細菌的耐藥性分布情況

日化用品、涂料及膠粘劑變質(zhì)樣中細菌數(shù)量較多的各類菌株及其耐藥性情況統(tǒng)計如表5和表6所示。由表可得，在四種殺菌防腐條件下，前者耐藥菌數(shù)量分布情況為：BIT>MIT>BP>卡松(菌數(shù))，后者為BIT>MIT>卡松>BP(菌數(shù))，兩種變質(zhì)樣的耐藥菌均主要為假單胞菌且易對異噻唑啉酮類殺菌防腐劑(MIT、BIT)產(chǎn)生耐藥性。涂料及膠粘劑變質(zhì)樣的假單胞菌不管是總菌株數(shù)量還是對四種防腐劑產(chǎn)生耐藥性的菌株數(shù)量都大于日化用品，這可能是由于日化用品經(jīng)常需要與人體接觸，因此防腐體系比涂料及膠粘劑溫和很多，殺菌防腐劑添加量不會那么高，從而使得細菌產(chǎn)生的耐藥性不高，而涂料及膠粘劑中殺菌防腐劑的種類和添加量都比較大，因此細菌對不同殺菌防腐劑產(chǎn)生的耐藥性情況也更多。其中，日化變質(zhì)樣的假單胞菌總數(shù)為53株，篩選出的耐藥菌有43株(占比為81.13%)，主要含有類產(chǎn)堿假單胞菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和氧化吲哚假單胞菌，而涂料及膠粘劑變質(zhì)樣的假單胞菌總數(shù)為92株，篩選出的耐藥菌有78株(占比為84.78%)，主要含有銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、殺香魚假單胞菌、門多薩假單胞菌和氧化吲哚假單胞菌。由此看出，兩類污染樣品分離出的假單胞菌中都有大于80%的菌株對四種防腐劑產(chǎn)生不同程度的耐藥性(主要為MIT和BIT)。

由表5和表6還可看出，除了假單胞菌外的其他細菌如芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、圓褐固氮菌等數(shù)量也都非常多，但是對四種殺菌防腐劑產(chǎn)生耐藥性的菌株卻非常少，由此說明引起工業(yè)產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的因素除了微生物產(chǎn)生耐藥性之外，與外界環(huán)境如空氣、原材料、工藝流程、生產(chǎn)用水、防腐劑殘留量等因素也密切相關(guān)，但是也不排除這些細菌自身一些生理、遺傳、代謝等因素所致，例如：芽孢桿菌自身會產(chǎn)生芽孢以抵御不良環(huán)境，芽孢折光性強且對熱、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑和其他理化因素有較強的抵抗力。當(dāng)然，也可能這些微生物產(chǎn)生的耐藥性是不可遺傳的，即未發(fā)生基因突變，因此容易因環(huán)境改變、菌種轉(zhuǎn)接而發(fā)生變化甚至消失。

表5 日化用品變質(zhì)樣中常見細菌的耐藥性情況

表6 涂料及膠粘劑變質(zhì)樣中常見細菌的耐藥性情況

3 結(jié)論與討論

常見變質(zhì)水性工業(yè)產(chǎn)品中的腐敗微生物以細菌為主，其中日化變質(zhì)樣主要含芽孢桿菌屬(11.36%)、克雷伯氏菌屬(21.36%)、假單胞菌屬(24.06%)和伯克霍爾德氏菌屬(10.00%)，涂料及膠粘劑污染樣主要含芽孢桿菌屬(18.52%)、假單胞菌屬(22.72%)和固氮菌屬(7.90%)。這些工業(yè)樣品含有許多可被微生物利用的營養(yǎng)物質(zhì)，芽孢桿菌中芽孢的形成不受氧氣供應(yīng)等條件的限制且對不良環(huán)境抵抗力強；而假單胞菌屬的細菌對營養(yǎng)需求要求低且可利用多種有機物，還可形成強有力的生物膜系統(tǒng)以抵御外界不良環(huán)境，生物膜還可促進其分泌耐熱蛋白酶[10-13]，這些特征保證了芽孢桿菌屬和假單胞菌屬細菌能在這些水性工業(yè)產(chǎn)品中占據(jù)優(yōu)勢地位。

變質(zhì)樣中對MIT和BIT產(chǎn)生耐藥性的細菌最多，分別占細菌總數(shù)的33.22%和35.45%，且假單胞菌屬的耐藥性細菌最多，日化變質(zhì)樣中的細菌耐藥性水平小于涂料及膠粘劑變質(zhì)樣中的細菌。據(jù)相關(guān)資料顯示[14]，革蘭氏陰性細菌更容易對異噻唑啉酮類殺菌防腐劑產(chǎn)生抗藥性，細菌細胞膜的成分及結(jié)構(gòu)與抗藥性機制密切相關(guān)。本研究日化變質(zhì)樣中的克雷伯氏菌屬(21.36%)和涂料及膠粘劑變質(zhì)樣中的芽孢桿菌屬(18.52%)、固氮菌屬(7.90%)數(shù)量很多，但是大多數(shù)對四種防腐劑無耐藥性，由此說明引起工業(yè)產(chǎn)品污染的腐敗微生物與耐藥性微生物有相關(guān)性但是概念和含義并不相同。耐藥性通常是指表型性狀上的改變，一般容易因環(huán)境變化而發(fā)生改變甚至消失，但是當(dāng)菌株發(fā)生了可遺傳變異時，耐藥性則不易受環(huán)境影響[15]。當(dāng)然，本研究所使用的耐藥性評價方法是否適用于所有細菌的耐藥性研究還有待考究。

為了減少工業(yè)產(chǎn)品的微生物污染，一方面要嚴格加強生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生監(jiān)管，另一方面需要定期抽樣調(diào)查本企業(yè)產(chǎn)品易被污染的微生物種類，并做最小抑菌濃度測試，從而能有針對性、科學(xué)性的挑選出最優(yōu)的防腐劑配方和劑量，保證產(chǎn)品質(zhì)量。