張博慧，賈戴輝，許俊彥

（寶船生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司藥物分析部門，上海 201203）

吐溫80又名聚山梨酯80，其化學(xué)名為聚氧乙烯20山梨醇酐單油酸酯，作為助溶劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，常用于治療性單克隆抗體注射液制劑中[1]。近年來，關(guān)于吐溫80能夠誘發(fā)過敏反應(yīng)的報(bào)道越來越多[2-6]，建立一種準(zhǔn)確有效的測(cè)定吐溫80含量的方法尤為重要。

目前，用于檢測(cè)吐溫80含量的方法主要有比色法[7]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）檢測(cè)法[8]、水解法[9]、質(zhì)譜法[10-11]等。比色法因?qū)υO(shè)備要求比較低而應(yīng)用廣泛，但該方法耗時(shí)、重復(fù)性較差，且對(duì)蛋白濃度較高樣品適用性差；HPLC-ELSD法檢測(cè)結(jié)果較準(zhǔn)確，應(yīng)用范圍較廣，但是ELSD系統(tǒng)易受蛋白污染而影響檢測(cè)結(jié)果；水解法是將吐溫80水解成油酸，利用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器檢測(cè)，該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，易受油酸穩(wěn)定性的影響；質(zhì)譜法需要使用昂貴的儀器，因此使用范圍受限。本研究建立了采用高效液相色譜儀配備熒光檢測(cè)器檢測(cè)單克隆抗體中吐溫80含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品單抗1、單抗2、單抗3均為寶船生物醫(yī)藥科技（上海）有限公司生產(chǎn)的單克隆抗體注射液；Humira（修美樂）購(gòu)自雅培公司；Opdivo（歐狄沃）購(gòu)自百時(shí)美施貴寶公司；Erbitux（愛必妥）購(gòu)自默克公司。

1.2 試劑與儀器

吐溫80（藥用級(jí)）購(gòu)自威爾藥業(yè)；十水四硼酸鈉（ACS試劑級(jí)）、N-苯基-1-萘胺（NPN， 98%）均購(gòu)自Sigma公司；氯化鈉（HPLC級(jí)）購(gòu)自阿拉丁公司；乙腈（ACN， HPLC級(jí)）購(gòu)自Fisher公司；反應(yīng)線圈（Reaction coil 750 μL）購(gòu)自賽默飛公司；1260高效液相色譜儀，安捷倫，配備熒光檢測(cè)器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

柱溫箱溫度25 ℃，樣品盤溫度5 ℃，熒光檢測(cè)器λex=350 nm、λem=420 nm；流動(dòng)相為 0.15 mol/L氯化鈉、0.025 mol/L十水四硼酸鈉、5.0% ACN、5.0 mol/L NPN、2.5 mg/L吐溫80；流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；等度洗脫。

1.3.2 除蛋白試驗(yàn)

（1）分別將1倍、3倍、5倍和7倍體積的乙醇-氯化鈉飽和溶液以及5倍體積的乙醇、乙腈加入樣品中，震蕩后離心，取上清測(cè)蛋白濃度。將上清干燥后用超純水復(fù)溶，上機(jī)檢測(cè)吐溫80含量。

（2）由3名實(shí)驗(yàn)人員分別用5倍體積的乙醇-氯化鈉飽和溶液沉淀蛋白，進(jìn)行吐溫80含量的測(cè)定。

1.3.3 蛋白干擾試驗(yàn)

將不含吐溫80的樣品用超純水稀釋至蛋白濃度分別為20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL和60 mg/mL，應(yīng)用“1.3.1”色譜條件直接進(jìn)樣分析。

1.3.4 方法驗(yàn)證

1.3.4.1 專屬性

分別取陰性對(duì)照樣品（不含吐溫80，蛋白濃度20 mg/mL）、不含吐溫80的稀釋緩沖液、濃度為0.1 mg/mL的吐溫80標(biāo)準(zhǔn)液和單抗1進(jìn)行吐溫80含量檢測(cè)，驗(yàn)證各樣品色譜圖在吐溫80保留時(shí)間內(nèi)的出峰情況。

1.3.4.2 精密度

平行取6份單抗1進(jìn)行吐溫80含量檢測(cè)，計(jì)算6個(gè)結(jié)果的保留時(shí)間和吐溫80含量的RSD值進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證；由另一名實(shí)驗(yàn)人員重復(fù)該操作，計(jì)算兩名實(shí)驗(yàn)人員12個(gè)結(jié)果的保留時(shí)間和吐溫80含量的RSD值，并進(jìn)行中間精密度驗(yàn)證。

1.3.4.3 準(zhǔn)確度

配制吐溫80含量分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL和0.80 mg/mL，蛋白含量均為20 mg/mL的樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)各濃度樣品的吐溫80回收率。

1.3.4.4 線性和范圍

將吐溫80標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至濃度為0.800 mg/mL、0.400 mg/mL、0.200 mg/mL、0.100 mg/mL、0.050 mg/mL和0.025 mg/mL，進(jìn)行吐溫80含量檢測(cè)。以吐溫80含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制回歸方程，并計(jì)算R2。符合精密度、準(zhǔn)確度和線性的吐溫80含量范圍即為該方法的檢測(cè)范圍。

1.3.4.5 耐用性

將樣品置于樣品儲(chǔ)存室（5±3）℃內(nèi)，分別于0 h、8 h、24 h和48 h進(jìn)行吐溫80含量檢測(cè)，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于0 h的吐溫80含量的相對(duì)差值。應(yīng)用不同批號(hào)的反應(yīng)線圈分別進(jìn)行吐溫80含量的檢測(cè)，計(jì)算兩個(gè)結(jié)果的相對(duì)差值。

1.3.5 單克隆抗體注射液中吐溫80含量的測(cè)定

應(yīng)用“1.3.1”色譜條件對(duì)6種單克隆抗體注射液進(jìn)行吐溫80含量的檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 除蛋白研究

為了消除蛋白對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，對(duì)供試品（單抗1，蛋白濃度20 mg/mL，吐溫80含量0.1 mg/mL）進(jìn)行除蛋白研究。用不同有機(jī)試劑（乙醇、乙腈、乙醇-氯化鈉飽和溶液）及不同比例的乙醇-氯化鈉飽和溶液沉淀蛋白，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，雖然用乙醇沉淀蛋白后吐溫80檢測(cè)結(jié)果最高，但是由于其除蛋白效果較差，吐溫80含量結(jié)果偏高有可能是受到蛋白的干擾所致。用乙腈及不同比例的乙醇-氯化鈉飽和溶液除蛋白效果良好，5倍體積的乙醇-氯化鈉飽和溶液吐溫80回收率相對(duì)較好。

表1 不同種類和比例有機(jī)試劑除蛋白試驗(yàn)結(jié)果

由3名實(shí)驗(yàn)人員分別平行制備6個(gè)樣品，考察除蛋白操作的重復(fù)性。，試驗(yàn)結(jié)果見表2。表2結(jié)果表明，吐溫80的回收率低，重復(fù)性差。

表2 不同實(shí)驗(yàn)人員吐溫80檢測(cè)結(jié)果

2.2 蛋白質(zhì)干擾試驗(yàn)

由于除蛋白操作重復(fù)性差，吐溫80含量回收率低，因此考慮用直接進(jìn)樣的方法進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，這需要研究蛋白質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾。選擇與單抗1吐溫80含量一致的0.1 mg/mL吐溫80標(biāo)準(zhǔn)品作為參比，計(jì)算不同蛋白濃度樣品峰面積與0.1 mg/mL吐溫80標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的比值，結(jié)果見表3和圖1。結(jié)果表明，在蛋白含量為20～60 mg/mL，蛋白的干擾均較小。值得注意的是，蛋白含量越高，對(duì)檢測(cè)的干擾越大，因此對(duì)于高濃度的蛋白樣品，若選擇該方法進(jìn)行吐溫80含量的檢測(cè)，需要首先評(píng)估蛋白對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾程度，決定該方法是否適用。

圖1 蛋白干擾試驗(yàn)

表3 蛋白干擾試驗(yàn)

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性

圖2顯示，供試品和0.1 mg/mL吐溫80標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間和峰面積一致；陰性對(duì)照樣品峰和稀釋緩沖液幾乎無干擾（由于流動(dòng)相中添加了一定比例的吐溫80，所以稀釋緩沖液在吐溫80保留時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)倒峰，屬正?，F(xiàn)象）。

圖2 專屬性試驗(yàn)色譜圖

2.3.2 精密度

2.3.2.1 重復(fù)性

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表4，由結(jié)果可知，6個(gè)結(jié)果中保留時(shí)間和吐溫80含量的RSD值分別為0.5%和0.4%。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2.2 中間精密度

中間精密度結(jié)果見表5，由結(jié)果可知，2名操作人員12個(gè)結(jié)果中保留時(shí)間和吐溫80含量的RSD值分別為0.4%和2.2%，說明該方法的精密度良好。

表5 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見表6，結(jié)果表明3個(gè)濃度水平的樣品回收率分別為105%、98%和108%，在90%～110%，說明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 線性和范圍

線性試驗(yàn)結(jié)果如表7所示，結(jié)果表明在0.025～0.800 mg/mL范圍內(nèi)，吐溫80含量和峰面積線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2×108X-4×106，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1。由以上結(jié)果可知，符合重復(fù)性、準(zhǔn)確度和線性的檢測(cè)范圍為0.05～0.80 mg/mL。

表7 線性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 耐用性

2.3.5.1 樣品穩(wěn)定性

樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表8，結(jié)果表明樣品在儀器樣品儲(chǔ)藏室（2～8 ℃）中放置8 h、24 h和48 h后，吐溫80含量與0 h的相對(duì)差值分別為3.0%、4.0%和1.0%，說明樣品在儀器樣品儲(chǔ)藏室內(nèi)放置48 h后對(duì)檢測(cè)結(jié)果幾乎無影響。

表8 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.5.2 反應(yīng)線圈批次

反應(yīng)線圈批次試驗(yàn)結(jié)果見表9，結(jié)果表明應(yīng)用不同批次的反應(yīng)線圈的相對(duì)差值為3.3%，說明反應(yīng)線圈批次對(duì)檢測(cè)結(jié)果無影響。

表9 反應(yīng)線圈批次試驗(yàn)結(jié)果

2.4 方法適用性研究

應(yīng)用本方法對(duì)6種單克隆抗體注射液進(jìn)行吐溫80含量的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表10。結(jié)果顯示實(shí)測(cè)值與理論值的偏差介于0%～15%，準(zhǔn)確度較高。

表10 方法適用性研究結(jié)果

在HPLC-FLD方法中，吐溫80膠束可被熒光基團(tuán)NPN標(biāo)記，在波長(zhǎng)為350 nm的紫外光激發(fā)下發(fā)出波長(zhǎng)為420 nm的熒光信號(hào)，經(jīng)熒光檢測(cè)器檢測(cè)后形成色譜圖。該方法會(huì)在流動(dòng)相中添加一定比例的吐溫80，這樣保證了檢測(cè)過程中吐溫80含量均大于臨界膠束濃度，從而使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確[12]。該方法為單克隆抗體注射液中吐溫80含量的測(cè)定提供了另一種不同原理的檢測(cè)方法，具有分析時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠以及成本低等優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)論

本研究表明，中低濃度蛋白含量（＜60 mg/mL）的樣品對(duì)吐溫80含量檢測(cè)結(jié)果幾乎無干擾，而高濃度的單克隆抗體注射液，蛋白質(zhì)的干擾是不能忽略的，因此消除蛋白對(duì)檢測(cè)的干擾，提高高濃度蛋白含量樣品的準(zhǔn)確性，仍然是本方法需要關(guān)注和研究的內(nèi)容。本研究針對(duì)HPLC-FLD法檢測(cè)單克隆抗體注射液中吐溫80含量進(jìn)行了專屬性、精密度、準(zhǔn)確度、線性和范圍、耐用性的驗(yàn)證，并采用不同的單抗注射液進(jìn)行了該方法的適用性研究，證明該方法適用于中低濃度蛋白含量（＜60 mg/mL）單克隆抗體注射液中吐溫80含量的檢測(cè)。