沈紅霞，倪柏鋒，王 彬，虞一聰，周 煒，周芷錦，穆 琳，桂平雄，趙靈燕

(浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 311199)

布魯氏菌病血清學(xué)檢測方法主要有平板凝集試驗(yàn)(BPAT)、虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和熒光偏振試驗(yàn)(FPA)等,以補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)診斷布病的特異性最強(qiáng)，其敏感性也較高，是國際公認(rèn)的血清學(xué)確診方法。

補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)包括兩個(gè)系統(tǒng)，并需要5種成分。第一個(gè)系統(tǒng)是反應(yīng)系統(tǒng)，將布魯氏菌抗原與被檢血清以及補(bǔ)體混合，如果被檢血清含有布病抗體，抗體與布魯氏菌抗原結(jié)合形成復(fù)合物，抗體的分子構(gòu)型改變，處于Fc段上的補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)暴露，這時(shí)補(bǔ)體與之結(jié)合，結(jié)合的補(bǔ)體不再游離，使其不能再參與第二指示系統(tǒng)即溶血系統(tǒng)反應(yīng)。在加入被致敏的綿羊紅細(xì)胞(即與溶血素結(jié)合的紅細(xì)胞)時(shí)，由于所有補(bǔ)體已在第一系統(tǒng)反應(yīng)時(shí)被結(jié)合，則不會(huì)發(fā)生溶血，即判定為陽性反應(yīng)；反之則會(huì)發(fā)生溶血，判定為陰性反應(yīng)[1]。本文著重介紹了補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法，并將其結(jié)果與cELISA結(jié)果進(jìn)行比較，以供同行參考。

1 材料

1.1儀器設(shè)備 培養(yǎng)箱(4111，Thermo)，水浴鍋(WNB45,MEMMERT)，滅菌器(SX-700，TOMY)，生物安全柜(1300 SERIES A2，Thermo),移液器(100～1000 μL,Eppendorf)，一次性移液管、玻璃試管、試管架、滅菌移液器吸頭等。

1.2試劑

1.2.1補(bǔ)體結(jié)合抗原、溶血素、補(bǔ)體、陰陽性標(biāo)準(zhǔn)血清 補(bǔ)體結(jié)合抗原(批號：2020)，溶血素(批號：2019)，補(bǔ)體(批號：2019)，陽性標(biāo)準(zhǔn)血清(批號：202005))，陰性標(biāo)準(zhǔn)血清(批號：202005),上述試劑均購于青島中創(chuàng)匯科。

1.2.2綿羊紅細(xì)胞懸液 采取成年公綿羊血，按常規(guī)方法脫纖、洗滌、離心，用稀釋液洗滌至上清無色為止，最后以2000 r/min離心定容。取紅細(xì)胞用稀釋液配制成2.5%紅細(xì)胞懸液(2.5 mL/100 mL)備用。

1.2.3滅菌生理鹽水 本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3檢測樣品 經(jīng)cELISA試劑盒(批號18121701，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)檢測的43份牛羊血清，其中：牛陽性血清11份，羊陽性血清12份；牛陰性血清10份，羊陰性血清10份。

2 方法

按動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)(GB/T18646-2018)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)常量法進(jìn)行操作及判定[2]。

2.1溶血素效價(jià)測定 按表1加入各成分混勻后置37～38 ℃水浴20 min，從水浴中取出，立即判定結(jié)果。結(jié)果判定見表1，能使2.5%紅細(xì)胞液完全溶血的最小量溶血素為溶血素效價(jià)或一單位溶血素，本次試驗(yàn)溶血素效價(jià)為3000倍稀釋液500 μL，二單位溶血素的工作效價(jià)為1500倍稀釋液500 μL。

表1 溶血素效價(jià)測定表(μL)

2.2補(bǔ)體效價(jià)測定 按表2加入各成分混勻后經(jīng)2次37～38 ℃水浴20 min，最后一次水浴后立即判定結(jié)果。結(jié)果判定見表2，三個(gè)對照管及陽性血清加抗原的試管為完全不溶血，陽性血清未加抗原及陰性血清無論有無加抗原的試管發(fā)生完全溶血所需最小補(bǔ)體量，即為補(bǔ)體效價(jià)或一單位補(bǔ)體。本次試驗(yàn)補(bǔ)體效價(jià)為14倍稀釋補(bǔ)體310 μL，計(jì)算得主試驗(yàn)原補(bǔ)體稀釋倍數(shù)為22.58，補(bǔ)償操作中效價(jià)降低，使用濃度比補(bǔ)體效價(jià)大10%，因此最終使用補(bǔ)體工作效價(jià)為20.32倍稀釋原補(bǔ)體500 μL。

2.3溶血標(biāo)準(zhǔn)比色管制備 按表3配置溶血標(biāo)準(zhǔn)比色管，用于抗原效價(jià)測定及主試驗(yàn)結(jié)果的判定。

表2 補(bǔ)體效價(jià)測定(μL)

表3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)溶血標(biāo)準(zhǔn)比色管制備(μL)

2.4抗原效價(jià)測定 將陰性對照血清作1∶10稀釋，陽性血清稀釋成1∶10，1∶25，1∶50，1∶75，1∶100，5個(gè)稀釋度，分別按表4加入各種成分，經(jīng)2次37～38 ℃水浴20 min，最后一次水浴后立即判定結(jié)果，觀察記錄各管溶血百分?jǐn)?shù)。結(jié)果判定見表5，抗原對陰性血清應(yīng)完全溶血，陽性血清各稀釋度發(fā)生抑制溶血最強(qiáng)的抗原最高稀釋度為抗原效價(jià)。本次試驗(yàn)抗原效價(jià)為1∶150，主試驗(yàn)使用抗原稀釋度應(yīng)比測定效價(jià)濃25%，最終抗原工作效價(jià)為1∶112.5。

表4 抗原效價(jià)測定(μL)

表5 抗原效價(jià)滴定結(jié)果

2.5主試驗(yàn) 對43份牛羊血清進(jìn)行檢測，試驗(yàn)設(shè)陰性血清、陽性血清、抗原、溶血素和補(bǔ)體對照，主試驗(yàn)各要素添加量和順序見表6。具體操作如下：

(1)將1∶10稀釋受檢血清、陰陽性對照血清滅能，分別加入2支玻璃試管內(nèi)，每管500 μL。其中一管加工作量抗原500 μL，另一管加稀釋液500 μL。

(2)上述2管均加工作量補(bǔ)體，每管500 μL，震蕩混勻。

(3)置37 ℃水浴20 min，取出放于室溫環(huán)境中。每管各加2單位的溶血素500 μL和2.5%紅細(xì)胞懸液500 μL。充分震蕩混勻。

(4)再置37 ℃水浴20 min，取出立即進(jìn)行第一次判定。

結(jié)果判定，以溶血標(biāo)準(zhǔn)比色管為參照，0～40%溶血判為陽性反應(yīng)；50%～90%溶血判為可疑；100%溶血判為陰性反應(yīng)。初判后靜置12 h作第二次判定。

表6 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)主試驗(yàn)(μL)

3 結(jié)果與分析

3.1補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測結(jié)果 通過上述補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)方法檢測43份牛羊血清，經(jīng)兩次判定后，試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果

3.2補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)與cELISA結(jié)果分析 以cELISA結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)，采用四格表法分別對補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果的Kappa一致性、敏感性、特異性、準(zhǔn)確性進(jìn)行比較分析(表8-9)[3]。本次試驗(yàn)兩種檢測方法結(jié)果一致性較差，Kappa值為0.3499，CFT特異性為70%，較敏感性(65.22%)及準(zhǔn)確性(67.44%)稍高。

表8 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)與cELISA結(jié)果

表9 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)與cELISA比較

一致性：Kappa=[43×29-(21×23+22×20)]÷[43×43-(21×23+22×20)]≈0.3499

敏感性：M=15÷(15+8)×100%=65.22%

特異性：T=14÷(6+14)×100%=70.00%

準(zhǔn)確性：Z=(15+14)÷43×100%=67.44%

4 討論

我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗原系用我國自主知識產(chǎn)權(quán)的疫苗株布魯氏菌S2株或S2和A99菌株，通常使用S2株[1]。在反芻類動(dòng)物中，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對接種牛種布魯氏菌S19或A19、羊種布魯氏菌RevI弱毒疫苗所產(chǎn)生的抗體相對不敏感，而對自然感染布魯氏菌病的動(dòng)物有很高的敏感性和特異性。在反芻類動(dòng)物,主要的補(bǔ)體結(jié)合抗體為IgG1，IgG2不結(jié)合豚鼠補(bǔ)體而且能夠阻止其他的免疫球蛋白結(jié)合補(bǔ)體而產(chǎn)生前帶現(xiàn)象[1]。IgM可結(jié)合補(bǔ)體但其結(jié)合能力可因滅活血清時(shí)的加熱而受到影響。在56 ℃滅活時(shí)幾乎沒有影響，而溫度升高到65 ℃時(shí)，IgM結(jié)合補(bǔ)體的能力則被完全破壞[1]。

抗補(bǔ)體現(xiàn)象是補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中必須注意的問題。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因較多，如血清中存在的某種脂類和變性的球蛋白能吸附大量的補(bǔ)體、血清存放時(shí)間太久或被細(xì)菌污染以及所用的玻璃試管等儀器不潔凈均能導(dǎo)致抗補(bǔ)體現(xiàn)象的出現(xiàn)[4][5]。為防止產(chǎn)生抗補(bǔ)體現(xiàn)象，要求血清和所用的診斷抗原均不能被細(xì)菌所污染。采血后要立即分離血清，并及時(shí)操作或冰凍保存，所用的玻璃試管等器材必須十分清潔。

為了準(zhǔn)確測定被檢血清中的布病抗體，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中除了被檢血清，其他4種成分效價(jià)必須經(jīng)過仔細(xì)測定，在主試驗(yàn)中處于平衡狀態(tài)。補(bǔ)體量少導(dǎo)致不完全溶血，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；反之，補(bǔ)體過量不能被第一反應(yīng)系統(tǒng)的免疫復(fù)合物完全結(jié)合從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果；溶血素量少，則溶血不完全，陰性血清被誤判弱陽性；溶血素過量，則會(huì)延緩溶血時(shí)間；抗原過量會(huì)影響補(bǔ)體的結(jié)合；抗原不足不能完全結(jié)合補(bǔ)體等情況，最終都有可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[1，4]。每次進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)前，各成分效價(jià)都要重新測定，操作繁瑣，量化要求嚴(yán)格，這也就導(dǎo)致該方法難以普遍推廣應(yīng)用。