章曉煒，朱志偉，馬敏彪，劉莉君，王友杉

(1.浙江省畜牧技術(shù)推廣與種畜禽監(jiān)測(cè)總站，浙江 杭州 310021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所； 3.紹興市嵊花種豬有限公司)

畜禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分，是維護(hù)國(guó)家生態(tài)安全、農(nóng)業(yè)安全的重要戰(zhàn)略資源，是畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，畜禽遺傳資源一旦滅絕，具有不可再生性。為有效應(yīng)對(duì)非洲豬瘟威脅，2019年3月至10月期間，浙江省采集制作凍存了9個(gè)地方豬種83個(gè)家系，97頭公豬的精液，共計(jì)9.3萬(wàn)劑，每劑0.25 mL，為確保我省地方豬種資源不丟失，作了很必要的資源儲(chǔ)備。

為進(jìn)一步評(píng)定地方豬精液冷凍保存效果與探索利用方式，本項(xiàng)目結(jié)合嵊縣花豬國(guó)家級(jí)保種場(chǎng)實(shí)際需求，開展地方豬凍精配種繁育復(fù)群試驗(yàn)研究，旨在檢驗(yàn)冷凍精液的配種效果，以及滿足地方豬保種場(chǎng)擴(kuò)充保種群體的實(shí)際需求開展本次研究。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1冷凍精液 根據(jù)已制作凍精數(shù)量、保種資源場(chǎng)需求、飼養(yǎng)管理等因素，擬在嵊縣花豬保種場(chǎng)開展冷凍精液配種繁育研究，該場(chǎng)有后備母豬20頭，每個(gè)家系擬使用凍精數(shù)量詳見表1。

1.1.2受體母豬 嵊縣花豬保種場(chǎng)有10個(gè)家系，每個(gè)家系擬配2頭母豬，可配母豬20頭，實(shí)際配種19頭母豬。受試母豬達(dá)體成熟，性周期節(jié)律正常、健康狀況良好，生殖器官無異常，免疫程序記錄完整(受體母豬的體重大于60 kg、月齡在6月齡以上、初情期后觀測(cè)2個(gè)發(fā)情期)。

1.1.3試驗(yàn)程序 采用母豬定時(shí)輸精程序中的同步處理方法： 試驗(yàn)豬在發(fā)情間期內(nèi)任一天開始投藥記為第1天，每天14:00后在喂料之前以拌料投飼方式給后備母豬飼喂烯丙孕素20 mg/頭，連續(xù)飼喂 18 d，第19天停藥1 d。第20天08:00 給每頭后備母豬肌肉注射PMSG 1 000 IU，第23天16:00給每頭后備母豬肌肉注射GnRH 100 μg。第24天16:00對(duì)所有后備母豬進(jìn)行第1次配種，第25天 08:00對(duì)所有后備母豬進(jìn)行第2次配種，第26天上午對(duì)仍表現(xiàn)靜立反應(yīng)的母豬補(bǔ)配1次。

表1 擬使用的凍精家系數(shù)量及使用計(jì)劃(實(shí)際配種19頭)

1.1.4凍精解凍復(fù)蘇 (1)稀釋液準(zhǔn)備：輸精前提取稀釋液30-40 mL在36 ℃水浴平衡20 min以上。(2)解凍步驟：提取凍精迅速投入50 ℃水浴鍋中，來回?fù)u晃8-10 s(或16 s)，拭干切口，倒入稀釋液管，混勻，殘留樣預(yù)觀活力，5-10 s，移入36 ℃水浴鍋，裝瓶恒溫保存，待輸。

1.1.5輸精劑量 按定時(shí)輸精程序中查情點(diǎn)確認(rèn)輸精時(shí)間，采用“深部輸精法(AI)”間隔12 h，2次/頭的輸精標(biāo)準(zhǔn)深部法導(dǎo)入復(fù)蘇精液，劑量為20億/40 mL的標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.6B超早孕檢查 AI操作實(shí)施豬只在正常情期18-20 d后觀測(cè)是否發(fā)情，并在30 d左右進(jìn)行B超早孕檢查確認(rèn)，若確認(rèn)有早期孕囊的則判定為受胎，未懷孕的依據(jù)試驗(yàn)程序再次輸精配種。

2 結(jié)果與分析

2.1庫(kù)存冷凍精液質(zhì)量檢測(cè) 凍精的保存質(zhì)量及凍后品質(zhì)和受精能力直接影響人工授精的成功率與母畜受胎率與產(chǎn)仔率。衡量精液冷凍后的主要技術(shù)指標(biāo)為凍后復(fù)蘇活力(直線運(yùn)動(dòng)精子的百分比率)。本試驗(yàn)實(shí)施期間，委托浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院檢測(cè)?？傮w評(píng)價(jià)為：大部分樣品凍后活力在0.30以上，凍精合格率為82.8%。

2.2稀釋液配方 解凍復(fù)蘇的精子需要有一定能量、滲透壓、pH的緩沖稀釋液作為載體，以期通過稀釋液獲取能量，增加精子的運(yùn)動(dòng)能力提高受精率。稀釋液配方：葡萄糖3.7 g，EDTA 8.125 g，二水檸檬酸三鈉0.5 g，NaHCO30.125 g，KCl 0.0075 g，雙抗1%，PVA，茶堿或咖啡因5 mM，稀釋液pH 7.25，滲透壓315 mOsm/L。

2.3后備母豬定時(shí)輸精同步發(fā)情程序 試驗(yàn)豬主要為后備母豬，由于初情期的不一致，自然發(fā)情周期無疑存在差異，為此，進(jìn)行了后備母豬同期操作處理。按精準(zhǔn)定時(shí)輸精(投藥+PMSG+GnRH)操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：精準(zhǔn)定時(shí)輸精同步發(fā)情率達(dá)100%(15/15)(表2)，并順利進(jìn)行了深部輸精凍精授配，受胎6頭，受胎率為40%，證實(shí)此程序可以進(jìn)行后備母豬同步發(fā)情處理。

表2 后備母豬定時(shí)輸精同步發(fā)情結(jié)果

2.4冷凍精液配種結(jié)果 本次試驗(yàn)共2批次對(duì)19頭試驗(yàn)豬操作，先后受胎11頭，總受胎率57.89%，獲得嵊縣花豬仔豬36頭，頭均產(chǎn)仔3.27頭(表3)，公母均衡，扣除木乃伊及死淘，存活31頭。

表3 受胎產(chǎn)仔情況

3 小結(jié)及討論

3.1本次實(shí)驗(yàn)證明，采用冷凍精液保存地方豬遺傳資源是可行的，這為地方豬種的保種方式提供了一種新的途徑。

3.2試驗(yàn)中反映出指標(biāo)，如受胎率、產(chǎn)仔率偏低的結(jié)果，一方面可能是受采精公豬的影響，如公豬年齡老化，采精時(shí)，精子活力偏低等客觀原因；另一方面也為今后繼續(xù)開展相關(guān)技術(shù)研究，進(jìn)一步提高凍精質(zhì)量，提供了參考意義。

3.3本次試驗(yàn)，通過開展相關(guān)技術(shù)研究建立了地方豬種精液的冷凍、批量解凍、稀釋定容、受體豬的同步發(fā)情、定時(shí)深部輸精等集成的配套地方豬冷凍精液應(yīng)用復(fù)繁技術(shù)體系，成功產(chǎn)出了嵊縣花豬8個(gè)家系的仔豬，這對(duì)地方豬種及其它品種資源的保護(hù)和利用具有重大的意義。