趙金金， 張海光， 崔非非， 汪 磊， 莫清江， 焦路陽

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科, b.婦產(chǎn)科， 河南 新鄉(xiāng) 453100

肝癌在我國一直是高發(fā)性腫瘤，其致死率位居第二，僅次于肺癌[1]。干細(xì)胞具有無限增殖和多向發(fā)育的特性[2]，腫瘤干細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性,且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及藥物耐受方面發(fā)揮重要作用[3]，目前靶向腫瘤干細(xì)胞的腫瘤治療已經(jīng)成為研究的新熱點(diǎn)。CD133是一種細(xì)胞表面糖蛋白，與多種癌癥(包括腦、前列腺、肝癌、胰腺和結(jié)腸癌)中的腫瘤干細(xì)胞相關(guān)[4-5]。

腫瘤由于生長迅速局部通常呈現(xiàn)出缺氧狀態(tài)，此時(shí)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)1α高表達(dá)[4]。HIF-1α對(duì)腫瘤的增殖、遷移都發(fā)揮著重要的作用[6]，同時(shí)研究[7]顯示耐藥的腫瘤細(xì)胞其HIF-1α的表達(dá)水平顯著高于非耐藥細(xì)胞。缺氧時(shí)HIF-1α促進(jìn)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CD133，以提高干細(xì)胞的比例從而使其對(duì)化療藥物耐受，這一機(jī)制已在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌中得到證實(shí)[4-5]。但是，HIF-1α在肝細(xì)胞癌耐受化療藥物方面的研究較少，HIF-1α能否通過誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的耐受仍未知，因此本研究擬探討HIF-1α對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2干細(xì)胞特性及其對(duì)表阿霉素耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑與儀器 人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會(huì)細(xì)胞庫，培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，DMEM高糖培養(yǎng)液購自Gibco，胎牛血清購自杭州四季青，LipoFiterTM3.0 轉(zhuǎn)染試劑購自漢恒生物科技有限公司，人CD133抗體購自BioLegend，凋亡試劑盒購自eBioscience，MTT、表阿霉素購自Sigma。HIF-1α抗體購自CST，HRP標(biāo)記的二抗購自Proteintech，超敏型ECL發(fā)光液購自Millipore。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長至90%密合度時(shí)消化細(xì)胞鋪板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞生長至90%密合度時(shí)細(xì)化鋪6孔板，每孔1×106細(xì)胞，第2天使用LipoFiterTM3.0試劑按照說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為3組：不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.0的對(duì)照組及轉(zhuǎn)染HIF-1α質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR)法檢測(cè)HIF-1α基因表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔中加入1 ml TRIzol試劑(Invitrogen)按照說明書提取總RNA并測(cè)定RNA濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gNDA Eraser(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；將所得cDNA用TB GreenTMPrimix Ex TaqTMⅡ(TaKARa)試劑盒按照說明書進(jìn)行熒光定量PCR；所用引物為HIF-1：上游引物，CCACAGGACAGTACAGGATG，下游引物，TCAAGTCGTGCTGAATAATACC；GAPDH：上游引物，GTCAACGGATTTGGTCGTATT，下游引物，ATCACTGCCACCCAGAAGACT。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)HIF-1α表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，PBS清洗細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，BCA法測(cè)濃度后加入5×loading buffer，SDS-PAGE電泳90 min，將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，HIF-1α抗體1∶1000稀釋后覆膜過夜，第2天TBST洗膜5次，加入二抗孵育1 h，加ECL發(fā)光液后于凝膠成像系統(tǒng)(Amersham Imager 600，美國GE)下拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD133表達(dá) 取HepG2組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各1×106個(gè)，PBS洗滌后加入含有CD133抗體的PBS 100 μl，避光染色20 min，PBS洗滌后流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 3組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后鋪96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，第2天加入0、 6.25、 12.5、 25、 50 μmol/L的表阿霉素作用24 h后，加入20 μl 0.5 mg/ml的MTT溶液，37 ℃孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)基加入200 μl DMSO，孵育10 min后測(cè)定A490。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 3組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后鋪6孔板，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，第2天加入50 μmol/L的表阿霉素作用48 h后，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入AnnexinV-FITC抗體染色20 min，PBS洗滌后加入5 μl PI，流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞并分析。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2020255。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α成功轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞 real-time qPCR結(jié)果顯示，對(duì)照組與HepG2組相比HIF-1α mRNA表達(dá)水平無差異，實(shí)驗(yàn)組HIF-1α的表達(dá)水平明顯高于HepG2組和對(duì)照組(P值均<0.001);Western Blot結(jié)果顯示，HepG2組和對(duì)照組HIF-1α蛋白基本不表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組HIF-1α高表達(dá)(圖1)。

注： a，real-time qPCR檢測(cè)HIF-1α質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞的表達(dá)；b，Western Blot檢測(cè)HIF-1α質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞的表達(dá)。

2.2 3組細(xì)胞CD133表達(dá)的比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，HepG2組及對(duì)照組細(xì)胞表面CD133陽性率分別為0.040% ± 0.003%和0.030%±0.010% ，實(shí)驗(yàn)組CD133的陽性率(20.110%±0.600%)明顯高于HepG2組及對(duì)照組(P值均<0.001)(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HepG2細(xì)胞CD133表達(dá)

2.3 表阿霉素對(duì)3組細(xì)胞活性的影響 不同濃度的表阿霉素作用于3種細(xì)胞24 h后細(xì)胞活性如表1所示。低劑量的表阿霉素(6.25、12.5 μmol/L)對(duì)細(xì)胞活性影響不大，且3組細(xì)胞間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；高劑量的表阿霉素(25、50 μmol/L)能夠顯著抑制HepG2組及對(duì)照組的細(xì)胞活性，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性影響不大，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性均顯著高于對(duì)照組和HepG2組(P值均<0.05)。

表1 不同濃度表阿霉素作用24 h的細(xì)胞活性

2.4 表阿霉素處理后3組細(xì)胞凋亡比較 50 μmol/L的表阿霉素作用于3組細(xì)胞48 h后，HepG2組及對(duì)照組的細(xì)胞凋亡比例分別為93.6%±1.5%和93.0%±1.2%，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡比例(67.9%±2.5%)較HepG2組及對(duì)照組明顯降低(P值均<0.001)(圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

3 討論

HIF-1α是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在正常狀態(tài)下細(xì)胞表達(dá)的HIF-1α分子很快的通過泛素-溶酶體途徑被降解[8-9]。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，特別是缺氧時(shí)HIF-1α能夠避免降解從而發(fā)揮多種生物學(xué)功能[10]。已有研究[4-5]證明HIF-1α與腫瘤細(xì)胞的能量代謝、內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、對(duì)化療藥物的耐受等過程息息相關(guān)。但是HIF-1α誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的具體機(jī)制仍不清楚。

腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤中一類能夠自我更新，維持腫瘤生長的細(xì)胞群[3]。目前公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物有CD133、CD44、CD24等[11]。腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物具有耐受性已經(jīng)得到共識(shí)。缺氧時(shí)HIF-1α可以誘導(dǎo)Sox2、Oct4等干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)[12]，這些蛋白進(jìn)一步調(diào)控CD133的表達(dá)，因此CD133被認(rèn)為是新的干細(xì)胞標(biāo)志物。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌中HIF-1α誘導(dǎo)的CD133表達(dá)同化療藥物耐受已經(jīng)得到證實(shí)，并有研究[4-5]闡述了其具體機(jī)制。

表阿霉素是治療肝細(xì)胞癌的常用化療藥物，其可通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而起到抑制腫瘤發(fā)展的作用[13-14]。然而腫瘤細(xì)胞對(duì)表阿霉素的耐藥性通常使其療效降低。筆者前期研究[15]結(jié)果顯示，HIF-1α高表達(dá)時(shí)肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞比例和對(duì)表阿霉素的耐藥性同時(shí)增加，這表明HIF-1α提高了腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性并且促進(jìn)其對(duì)化療藥物耐藥。通常確定腫瘤干細(xì)胞的方法有軟瓊脂實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)以及干細(xì)胞標(biāo)志物的檢測(cè)等[16]。本研究?jī)H檢測(cè)了一種干細(xì)胞標(biāo)志物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖略顯單薄，但也證明了干細(xì)胞比例的增加。

干細(xì)胞比例增加與表阿霉素耐受性的關(guān)系在本實(shí)驗(yàn)中并未得到充分的證實(shí)，后期將對(duì)高表達(dá)HIF-1α的肝癌細(xì)胞進(jìn)行CD133分子的敲低，進(jìn)一步研究HIF-1α、CD133與耐藥性的關(guān)系。

本研究中選用了CD133作為肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志物，流式細(xì)胞術(shù)顯示過表達(dá)HIF-1α后CD133的陽性率顯著增加。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和凋亡實(shí)驗(yàn)均顯示HIF-1α能夠降低肝癌細(xì)胞對(duì)表阿霉素的敏感性。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：趙金金負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；張海光負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作，參與數(shù)據(jù)分析；崔非非、汪磊參與實(shí)驗(yàn)操作；莫清江參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；焦路陽負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫論文并最后定稿。