王靜,蘇東風(fēng),李巖松,邰旭輝2,李迪,劉雨萌

(中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院,遼寧 沈陽 110042 1 神經(jīng)內(nèi)科； 2 耳鼻喉科)

帕金森病(PD)病人多見黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的選擇性丟失[1-2]，但不清楚此過程的發(fā)病機(jī)制。已發(fā)現(xiàn)Alzheimer病(AD)病人體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)過度增強(qiáng)以及神經(jīng)炎癥和凋亡級聯(lián)反應(yīng)的激活[3]，且在PD的多巴胺能神經(jīng)元變性中起關(guān)鍵作用[3-5]。α-共核蛋白(α-synuclein)異常積聚所參與引起的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病統(tǒng)稱為共核蛋白病，包括PD和AD等，表明α-synuclein可能在PD等神經(jīng)退行性疾病中起作用[6]。聚集體的α-synuclein蛋白是PD的病理學(xué)標(biāo)志物[7]，且在PD病人運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)生前能夠檢測出α-synuclein表達(dá)[8]。已有研究結(jié)果顯示，抑制α-synuclein的表達(dá)有助于改善砷誘導(dǎo)的多巴胺細(xì)胞PC12的凋亡[9]，表明α-synuclein有潛力成為PD診療的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一[10]。然而，α-synuclein對多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激的影響仍不明確。因此，本文通過在體外多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞中過表達(dá)α-synuclein，研究α-synuclein對細(xì)胞損傷、炎癥、氧化應(yīng)激的作用，旨在為PD病人認(rèn)知障礙的治療提供新靶點(diǎn)和新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞MES23.5(MZ-1693，明舟生物，寧波)；胎牛血清(Thermo Fisher Scientific，美國)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)和2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFDA，D6883，Sigma-Aldrich)(Merck KGaA，美國)；共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 700 Meta，Zeiss，德國)；超氧化物氣化酶(SOD)活性檢測試劑盒(S0109)和RIPA裂解緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所，上海)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELSIA)試劑盒(CSB-E08556m, 華美生物，武漢)；BCA蛋白測定試劑盒(Bio-Rad Laboratories，美國)；α-synuclein抗體(ab52168，Abcam，美國)；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因蛋白(Bcl-2)抗體(05-826)和Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)抗體(MAB4601)(EMD Millipore，美國)；兔抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶二抗(sc-358914，Santa Cruz Biotechnology，美國)；谷胱甘肽(GSH，70-18-8，Sigma-Aldrich，Merck KGaA，美國)；α-synuclein 過表達(dá)的重組pcDNA3.1+質(zhì)粒(pcDNA-α-synuclein)及pcDNA3.1+空質(zhì)粒陰性對照(pcDNA-NC)構(gòu)建(吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，上海)；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V，AV)-異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(KGA106，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，南京)；結(jié)合緩沖液(00-4222-57，Thermo)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理分組 將MES23.5細(xì)胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)0.05胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置37 ℃含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2濕潤培養(yǎng)箱。將MES23.5細(xì)胞分為5組?？瞻讓φ战M(①組)：無處理。pcDNA-NC組(②組)：細(xì)胞培養(yǎng)4 h后用空載質(zhì)粒處理4 h。α-synuclein過表達(dá)組(pcDNA-α-synuclein，③組)：用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h以重組質(zhì)粒pcDNA-α-synuclein處理24 h。α-synuclein過表達(dá)+H2O2組(H2O2+pcDNA-α-synuclein，④組)：用H2O2處理后的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后再以重組質(zhì)粒pcDNA-α-synuclein轉(zhuǎn)染24 h。α-synuclein+GSH(GSH+pcDNA-α-synuclein，⑤組)：用GSH處理后細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后以重組質(zhì)粒pcDNA-α-synuclein轉(zhuǎn)染24 h。重復(fù)6次。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率 用AV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒分析樣品凋亡變化。收集細(xì)胞，用冰冷PBS洗滌2次，以結(jié)合緩沖液(500 μL)懸浮細(xì)胞。隨后，細(xì)胞用AV-FITC試劑和碘化丙啶(PI)染色。在FACS Calibur流式細(xì)胞儀上通過Cell Quest軟件計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。

1.2.3細(xì)胞活性氧(ROS)水平檢測 使用熒光染料DCFDA檢測ROS水平。將MES23.5細(xì)胞以每孔2×104的密度接種在96孔細(xì)胞板中。將細(xì)胞與2.5 μmol/L的DCFDA在37 ℃下孵育15 min。然后，通過Car Zeiss共聚焦顯微鏡分別在485 nm激發(fā)和535 nm發(fā)射波長下獲得DCFDA熒光。利用共聚焦激光掃描顯微鏡自帶的ZEN 2008軟件計(jì)算ROS的相對含量。

1.2.4細(xì)胞內(nèi)SOD活力檢測 收集MES23.5細(xì)胞，使用冷的PBS溶液勻漿細(xì)胞，4 ℃離心后，取上清作為待測樣品，并嚴(yán)格按照總SOD活性檢測試劑盒說明檢測其活力。

1.2.5ELSIA檢測相關(guān)細(xì)胞因子 收集MES23.5細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液。采用相應(yīng)試劑盒分別檢測白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。

1.2.6Western blot法檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) 使用RIPA裂解緩沖液進(jìn)行總蛋白提取。使用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)的濃度。通過SDS-PAGE(120 g/L分離膠，40 g/L濃縮膠)分離蛋白樣品(每泳道20 μg)，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。室溫下使用50 g/L脫脂牛奶將膜封閉1 h，隨后在4 ℃下與α-synuclein抗體(1∶600)、Bax抗體(1∶200)和抗體Bcl-2(1∶500)反應(yīng)。將膜與兔抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶二抗(1∶5 000)在室溫下再孵育2 h。隨后，將膜用Tris緩沖液和聚山梨醇酯20洗滌7次(每次3 min)?；瘜W(xué)發(fā)光信號使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測試劑進(jìn)行顯色。使用Image J 1.4軟件分別計(jì)算α-synuclein、Bcl-2及Bax蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 α-synuclein過表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響

Western blot檢測結(jié)果表明，與空白對照組和pcDNA-NC組相比較，pcDNA-α-synuclein組中α-synuclein的表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=241.251、249.163，q=4.254～36.771，P<0.05)，pcDNA-NC組與空白對照組之間無明顯差異(P>0.05)。過表達(dá)α-synuclein效率檢測結(jié)果見圖1A、表1。細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果表明，與空白對照組和pcDNA-NC組相比較，pcDNA-α-synuclein組凋亡率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=233.214、316.201，q=6.725～41.202，P<0.05)；另外，空白對照組與pcDNA-NC組相比，凋亡率差異無顯著意義(P>0.05)。見圖1B、表1。

A：蛋白免疫印跡法檢測α-synuclein的表達(dá)；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測MES23.5的凋亡率。①空白對照組，②pcDNA-NC組，③pcDNA-α-synuclein組。

2.2 α-synuclein過表達(dá)對Bax/Bcl-2表達(dá)影響

Western blot的檢測結(jié)果表明，與空白對照組和pcDNA-NC組相比較，pcDNA-α-synuclein組中Bax表達(dá)和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=266.891～426.347，q=7.044～37.451，P<0.05)；空白對照組與pcDNA-NC組的Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)量均無明顯差異(F=0.014～0.052，q=2.142～4.477，P>0.05)。見圖2、表1。

表1 α-synuclein過表達(dá)對細(xì)胞凋亡和Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)影響

①空白對照組，②pcDNA-NC組，③pcDNA-α-synuclein組。

2.3 α-synuclein過表達(dá)對細(xì)胞SOD活力和ROS含量影響

與空白對照組和pcDNA-NC組比較，pcDNA-α-synuclein組中ROS含量上調(diào)，而SOD活力下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=198.523、188.544，q=6.261～35.668，P<0.05)；空白對照組與pcDNA-NC組的ROS含量和SOD活力均無明顯變化(P>0.05)。見表2。

2.4 α-synuclein過表達(dá)對細(xì)胞IL-6、IL-1β以及TNF-α水平影響

炎癥反應(yīng)檢測表明，與空白對照組和pcDNA-NC組相比較，pcDNA-α-synuclein組IL-6、IL-1β和TNF-α水平均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=201.33～315.52，q=3.256～36.214，P<0.05)；另外，與空白對照組相比，pcDNA-NC中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均無明顯變化(F=0.088～0.245，q=1.014～2.331，P>0.05)。見表2。

表2 α-synuclein過表達(dá)對細(xì)胞相關(guān)氧化損傷和細(xì)胞因子影響

2.5 細(xì)胞氧化損傷對細(xì)胞α-synuclein表達(dá)和凋亡影響

本文的檢測結(jié)果表明，pcDNA-α-synuclein組、H2O2+pcDNA-α-synuclein組和GSH+pcDNA-α-synuclein組α-synuclein表達(dá)量分別為0.999±0.087、1.932±0.207和0.623±0.076，細(xì)胞的凋亡率分別為(14.336±2.328)%、(22.667±2.541)%和(15.667±2.541)%。與pcDNA-α-synuclein組比較，H2O2+pcDNA-α-synuclein組α-synuclein表達(dá)增加，而GSH+pcDNA-α-synuclein組α-synuclein表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=268.41，q=11.218、41.205，P<0.05)。與pcDNA-α-synuclein比較，H2O2+pcDNA-α-synuclein組中細(xì)胞凋亡增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=159.25，q=21.362，P<0.05)，而GSH+pcDNA-α-synuclein組細(xì)胞凋亡無明顯變化(P>0.05)。

3 討 論

PD的特征是黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性及不可逆性丟失。該病是繼AD之后的第二大最常見的神經(jīng)退行性疾病[11]。研究表明，α-synuclein參與了多種生物過程，包括神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制和腦功能異常等[12]。synuclein家族包括α-、β-和γ-synuclein以及突觸膠，α-synuclein是其家族中的高豐度蛋白。盡管它們可能在神經(jīng)可塑性和對神經(jīng)元細(xì)胞損傷的反應(yīng)中起重要作用[13]，但是這些蛋白質(zhì)的確切生理作用尚不清楚。

α-synuclein是一種具有聚合成低聚物潛力的蛋白質(zhì)，其過表達(dá)可促進(jìn)多種細(xì)胞系和動(dòng)物模型中凋亡細(xì)胞的死亡[14]。α-synuclein的表達(dá)被認(rèn)為是重金屬誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的關(guān)鍵因素。在錳處理的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)伴隨α-synuclein的積聚增加，氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS水平的同時(shí)升高并導(dǎo)致SOD活力的減低以及氧化損傷增強(qiáng)。而且研究已表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)α-synuclein的翻譯后修飾并促進(jìn)α-synuclein積聚[15]。這表明α-synuclein和氧化應(yīng)激存在協(xié)同調(diào)節(jié)作用。另有研究結(jié)果表明，在表達(dá)α-synuclein的神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了與家族性PD相關(guān)的基因突變(A30P和A53T)，導(dǎo)致細(xì)胞對氧化應(yīng)激分子的敏感性增加[16]。本文結(jié)果顯示，過表達(dá)α-synuclein的多巴胺能神經(jīng)元中ROS含量明顯升高，而抗氧化劑SOD活力降低。表明α-synuclein可能提高多巴胺能神經(jīng)元的氧化應(yīng)激敏感性從而增加氧化傷害。

氧化應(yīng)激損傷在PD的發(fā)病機(jī)制中起核心作用[17]，而且異常表達(dá)的α-synuclein在細(xì)胞內(nèi)的長期積累能促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷和線粒體改變，可能導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元凋亡和死亡增加[18]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，在多巴胺能神經(jīng)元中過表達(dá)α-synuclein可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，并導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值的升高。Bcl-2和Bax這兩種蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)劑，Bax/Bcl-2比值的增加可導(dǎo)致促凋亡蛋白從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，增加細(xì)胞的凋亡[19]。此外，最近已證明α-synuclein被miRNA-7靶向抑制后，多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡減少[20]。另外，α-synuclein基因敲低可改善脊髓損傷大鼠的神經(jīng)細(xì)胞損傷[21]。在體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明，抑制α-synuclein的表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)神經(jīng)再生[22]。提示α-synuclein在細(xì)胞中的表達(dá)增加可能是PD病變中多巴胺能神經(jīng)元凋亡和死亡的關(guān)鍵原因，且與Bax/Bcl-2比值增加有關(guān)。

多種細(xì)胞過程如神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥、線粒體功能障礙等的協(xié)同作用參與PD病人神經(jīng)細(xì)胞損傷的發(fā)展[12,23]。本研究中除證實(shí)α-synuclein可以誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡和ROS增加外，還顯示α-synuclein過表達(dá)能增強(qiáng)多巴胺能神經(jīng)元的促炎癥反應(yīng)，在過表達(dá)α-synuclein多巴胺能神經(jīng)元的培養(yǎng)上清中，觀察到IL-6、IL-1β和TNF-α等水平都明顯上調(diào)。表明α-synuclein不僅誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，而且可能介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的促炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，從而加重神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

ROS的過量產(chǎn)生和氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)已被證明與PD相關(guān)，并導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡和凋亡[24]。近期的研究結(jié)果已表明，miRNA-7靶向抑制α-synuclein后可減輕多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和氧化損傷[25]。本文結(jié)果也表明，使用GSH處理α-synuclein過表達(dá)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞，不僅可抑制α-synuclein蛋白表達(dá)，而且使細(xì)胞凋亡率降低。說明抑制α-synuclein表達(dá)與多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的氧化損傷減弱有關(guān)。另外，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，體外神經(jīng)元細(xì)胞的氧化損傷中α-synuclein的表達(dá)異常增加[26]。而本研究證實(shí)，H2O2進(jìn)一步促進(jìn)了α-synuclein過表達(dá)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞中α-synuclein表達(dá)水平，提高其凋亡率。表明氧化應(yīng)激可能具有強(qiáng)化α-synuclein凋亡誘導(dǎo)的功能，進(jìn)一步加強(qiáng)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

綜上所述，α-synuclein對多巴胺能神經(jīng)元損傷具有促進(jìn)作用，而多巴胺能神經(jīng)元的氧化損傷可加重α-synuclein對細(xì)胞內(nèi)ROS、促炎癥因子和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。本研究豐富了PD的發(fā)病機(jī)制探索的理論基礎(chǔ)，為PD的診斷和治療提供了潛在靶標(biāo)。但本研究仍存在一些缺陷，今后需要在PD動(dòng)物模型體內(nèi)驗(yàn)證α-synuclein對多巴胺能神經(jīng)元損傷的調(diào)節(jié)作用。