李敏，李婷婷，彭湃，王恩彪，孟垚，李彥成，侯欣園，楊思宇，魏小娜＊

（1. 遼寧石油化工大學(xué)，遼寧 撫順 113001； 2. 沈陽(yáng)化工研究院有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110021）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年進(jìn)入環(huán)境的石油烴累計(jì)約800 萬(wàn)t，大量石油烴最終歸口于土壤，其帶來(lái)的土壤污染問(wèn)題日益突出。因此，石油烴污染土壤修復(fù)備受關(guān)注[1]。

微生物修復(fù)技術(shù)不會(huì)引起土壤結(jié)構(gòu)改變和二次污染，被廣泛應(yīng)用于含油土壤的修復(fù)[2]。但是，單一菌株降解效果差，且降解速率隨著時(shí)間延長(zhǎng)不斷降低。構(gòu)建復(fù)合菌群可利用不同菌株的協(xié)同作用，獲得較好的石油烴降解效果[3]。然而以游離菌形式進(jìn)入土壤的大部分外源降解菌易受土壤微環(huán)境變化、污染物本身的影響，不易定殖，難以達(dá)到預(yù)期效果。微生物固定化技術(shù)通過(guò)將微生物固定在相應(yīng)的載體上，使微生物在適宜條件下能夠快速、大量增殖并保持生物活性[4]。選擇適宜的固定化載體還可對(duì)土壤產(chǎn)生一定的保水作用，提高土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，提高微生物對(duì)有機(jī)質(zhì)、全氮和速效磷的利用率[5]。

本研究考察了篩選出的3 株石油烴降解菌去除石油烴的性能，采用吸附法制備固定化菌劑，比較了降解菌不同引入方式對(duì)污染物的去除性能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 污染物

所用石油為大慶油田原油，密度為0.858 g·cm-3（20 ℃），凝固點(diǎn)為25.6 ℃，黏度為20.9 mPa·s（50 ℃），該石油中飽和烴、芳香烴和膠質(zhì)瀝青質(zhì)所占比例分別為60.5%、33.5%和6.0%。

1.1.2 供試土壤

土壤取自遼寧省彰武縣無(wú)污染的土壤，采集20～40 cm 土層樣品，經(jīng)風(fēng)干、碾碎，去除殘根等雜質(zhì)，過(guò)2 mm 篩，后續(xù)用于微生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)。土壤的理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

石油烴污染土壤制備：取石油50 g 溶解于500 mL 丙酮，分散均勻后，邊攪拌邊添加到1 000 g土壤中；25 ℃避光條件下通風(fēng)老化，每日早晚各攪拌一次；待丙酮揮發(fā)完全后繼續(xù)通風(fēng)老化10 d，進(jìn)行滅菌處理，初始石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.32 g·kg-1，備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 為0.5 g·L-1，CaCl2為0.02 g·L-1，KH2PO4為1.0 g·L-1，NH4Cl 為2.0 g·L-1，F(xiàn)eCl3為0.05 g·L-1，pH=7。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨為10 g·L-1，酵母膏為5 g·L-1，氯化鈉為10 g·L-1，瓊脂粉為15 g·L-1， pH=7.2，121℃滅菌30 min。

1.1.4 供試菌株

采用前期實(shí)驗(yàn)從油田含油污泥中篩選出的C3、C4、C5 3 株具有石油烴降解性能的菌株作為供試菌株，經(jīng)16S rDNA 序列與Gene Bank 中已知序列進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定 C3 為Pseudomonas putida ， C4 為Acinetobacter calcoaceticus，C5 為Sphingomonas sp.。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原油降解率測(cè)定

按正交優(yōu)化條件下的最佳接種比例將3 株單菌的菌懸液進(jìn)行混合得復(fù)合菌劑。將活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單菌株和復(fù)合菌懸液（約109 cfu·mL-1）2 mL接入100 mL 含0.5%石油烴的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以不接菌的100 mL 含0.5%石油烴的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為對(duì)照，于30 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩搖床分別培養(yǎng)28 d。用三氯甲烷萃取培養(yǎng)基中的殘余油分，采用紅外分光光度法測(cè)定石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)。細(xì)菌生長(zhǎng)以波長(zhǎng)600 nm 處的濁度OD600 表示。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.2.2 固定化菌劑制備

取2.0 g 粒徑為0.25 mm 的生物炭作為載體，高壓滅菌后加入到100 mL LB 培養(yǎng)基中，接入6 mL復(fù)合菌懸液，30 ℃、150 r·min-1震蕩培養(yǎng)36 h，離心得到的菌體用生理鹽水洗滌2 次，即得固定化菌劑[6]。

1.2.3 不同菌劑加入方式對(duì)含油土壤的修復(fù)

稱取1 kg 經(jīng)過(guò)滅菌處理的石油烴污染土于花盆（直徑 18 cm、高 25 cm）中，保持土壤35%的濕度。試驗(yàn)共設(shè)5 組處理：滅菌污染土（CK）、添加生物炭（BC）、添加游離復(fù)合菌劑（TB）、添加固定化菌劑（CTB）、添加游離復(fù)合菌+生物炭（TB+BC），其中游離復(fù)合菌和固定化菌劑含同等生物量（約3×109～8×109cfu·g-1），每個(gè)添加生物炭的處理生物炭添加量相同，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行。分別于第 0、7、14、21、28 天進(jìn)行取土樣，測(cè)定土壤中石油烴質(zhì)量分?jǐn)?shù)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定土壤中的微生物量。

1.3 測(cè)試方法

采用梯度稀釋法對(duì)固定化菌劑和游離復(fù)合菌劑生物量進(jìn)行測(cè)定，具體方法為：將1.0 g 固定化菌劑加入錐形瓶中，加入100 mL 無(wú)菌水，180 r·min-1培養(yǎng)30 min。取菌液1 mL 進(jìn)行梯度稀釋后，進(jìn)行涂布平板計(jì)數(shù)。游離復(fù)合菌劑培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)量的確定亦取1 mL 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液進(jìn)行梯度稀釋，涂布平板計(jì)數(shù)[7]。計(jì)算1 mL 游離微生物菌液與1 g 固定化菌劑數(shù)量之間的關(guān)系[8]。

采用柱層析法分離石油烴族組分[9]，采用紅外分光測(cè)油儀測(cè)定分離出的族組分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的生長(zhǎng)曲線及石油烴降解性能

如圖1 所示，在發(fā)酵前期，發(fā)酵液中石油烴的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著菌體密度的增加而逐步降低。菌株C3的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為0～16 d，C4 的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為0～18 d，C5 的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為0～14 d。培養(yǎng)14 d 時(shí)，C3、C4、C5和復(fù)合菌石油烴降解率分別為30.58%、35.76%、29.45%、42.73%。菌株進(jìn)入凋亡期后，對(duì)培養(yǎng)基中的石油烴降解速率放緩。培養(yǎng)28 d 時(shí)，C3、C4、C5 和復(fù)合菌對(duì)石油烴的降解率分別為45.34%、48.58%、54.56%和79.73%。結(jié)果表明，3 株菌均可以石油烴作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期石油烴去除率與菌體生長(zhǎng)密度呈正相關(guān)，前14 d 對(duì)石油烴的降解能力復(fù)合菌＞C4＞ C3＞C5。14～28 d 期間，C3、C4對(duì)石油烴的降解率僅增加14.23%和12.25 %，C5 和復(fù)合菌對(duì)石油烴的降解率增加了24.45%和37.00%。

圖1 石油烴降解菌生長(zhǎng)曲線及石油烴殘留率變化

通過(guò)降解菌對(duì)石油烴不同組分的去除率（圖2）分析，可見(jiàn)C3、C4 對(duì)飽和烴的去除率高于對(duì)芳香烴的去除率，C5 對(duì)芳香烴的利用能力要優(yōu)于C3、C4，對(duì)烷烴的去除率在3 株菌種中最低。復(fù)合菌劑對(duì)飽和烴和芳香烴的去除率分別達(dá)到 84.93%和82.08%。這一現(xiàn)象可能與菌種對(duì)石油烴不同組分的選擇性降解有關(guān)。如Pseudomonas細(xì)菌可利用石油烴各組分，而Acinetobacter對(duì)石油組分的降解能力為烷烴＞環(huán)烷烴＞芳香烴[10]，Sphingomonas則被認(rèn)為對(duì)多種芳香族化合物具有高效降解能力[11]。通過(guò)對(duì)3 株菌的復(fù)配對(duì)石油烴各組分去除具有協(xié)同的效果，可大大提高石油烴去除率。

圖2 石油烴降解菌生長(zhǎng)曲線及石油烴殘留率變化

2.2 不同處理石油烴降解率變化

含油土壤修復(fù)過(guò)程中石油烴降解率變化如圖3所示。修復(fù)結(jié)束后，各處理石油烴平均降解率從高到低依次為CTB＞TB+BC＞TB＞BC＞CK。固定化復(fù)合菌對(duì)石油烴的去除率為78.32%，遠(yuǎn)高于其他處理。游離復(fù)合菌對(duì)石油烴平均降解率僅為45.81%，而在其生物量相當(dāng)?shù)那闆r在原油降解試驗(yàn)中游離復(fù)合菌對(duì)石油降解率達(dá)到79.73%，這是因?yàn)樵徒到庠诶硐氲呐囵B(yǎng)條件下進(jìn)行，且石油烴含量相對(duì)較低，而土壤環(huán)境要復(fù)雜的多，石油烴易吸附于土壤顆粒上導(dǎo)致其生物可給性差。CK 組最終石油烴去除率為2.96%，可能源于某些組分的揮發(fā)。對(duì)比TB+BC、TB、BC 3 組處理可見(jiàn)，復(fù)合菌和生物炭的簡(jiǎn)單混合可在一定程度上提高石油烴的降解率，且其降解率要高于TB 和BC 組降解率之和，說(shuō)明TB 和BC 聯(lián)用對(duì)石油烴的去除具有協(xié)同效應(yīng)，高于TB 和CK 的2 個(gè)對(duì)照組，它們的石油烴降解率為分別為46.81%、2.96%。固定化復(fù)合菌劑之所以能更好地促進(jìn)石油烴降解，是由于生物炭在吸附大量菌體的同時(shí)，石油烴被吸附在生物炭的孔隙中，增加了石油烴降解菌與石油烴的接觸，且生物炭表面的官能團(tuán)，易解碳源和氮源有助于增強(qiáng)降解菌活性，進(jìn)而提高石油烴降解率[12-13]。

圖3 修復(fù)過(guò)程中石油烴降解率隨時(shí)間變化

2.3 微生物數(shù)量

修復(fù)結(jié)束后各處理土壤微生物量如圖4 所示，土壤樣品中微生物數(shù)量由大到小順序依次為CTB＞ TB+BC＞ TB。這說(shuō)明，在修復(fù)石油烴污染土過(guò)程中，各處理石油烴降解菌株均能夠在污染土壤中有效定殖。其中 CTB 處理組微生物數(shù)量為7.2×1010cfu·g-1，比初始增加了1 個(gè)數(shù)量級(jí)，TB 處理微生物數(shù)量較初始降低了1 個(gè)數(shù)量級(jí)，TB+BC 處理較初始略有降低。這說(shuō)明生物炭的加入有利于降解菌在土壤中的定殖，以固定化微生物方式加入土壤對(duì)降解菌的數(shù)量增加最為有利。這可能是由于以生物炭作為載體為降解菌提供了適宜的生存環(huán)境，減少土壤中石油烴對(duì)微生物細(xì)胞的毒害作用[14-15]，從而有助于石油烴降解菌株的定殖和石油烴的降解。

圖4 修復(fù)結(jié)束后土壤微生物數(shù)量

3 結(jié)論

3 株石油烴降解菌株均能以石油烴為唯一碳源和能源生長(zhǎng)， 30 ℃培養(yǎng)28 d 后，C3、C4、C5 和復(fù)合菌對(duì)石油烴的降解率分別為45.34%、48.58%、54.56%和79.73%。C3、C4 對(duì)飽和烴的去除能力較強(qiáng)，C5 對(duì)芳香烴的去除能力較強(qiáng)，3 株菌復(fù)配后的復(fù)合菌對(duì)石油烴各組分的去除具有協(xié)同效果。

生物炭與復(fù)合菌聯(lián)用對(duì)石油烴的去除具有協(xié)同效應(yīng)，生物炭固定化復(fù)合菌對(duì)石油烴污染土壤修復(fù)效果最好，修復(fù)28 d 對(duì)石油烴的去除率為78.32%。

修復(fù)結(jié)束后，不同微生物添加方式下土壤中微生物數(shù)量表現(xiàn)出差異性，由大到小依次為CTB＞ TB+BC＞ TB。生物炭的加入有利于降解菌在土壤中的定殖，其中生物炭作為固定化載體加入土壤對(duì)降解菌的數(shù)量增加最為有利。