陳西朋，司偉民，孫玉梅*，李憲臻

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

生物表面活性劑具有促進(jìn)非水溶性液體與水混合乳化和降低液體表面張力的能力，又把有乳化能力的稱為生物乳化劑，把降低表面張力的稱為生物表面活性劑。目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)生物表面活性劑的瓶頸是產(chǎn)量低和成本高，解決途徑有分離高產(chǎn)微生物、優(yōu)化培養(yǎng)基成分和利用低成本原料等[1]。

產(chǎn)生物表面活性劑的微生物包括細(xì)菌、真菌和酵母。其中對假單胞菌（Pseudomonasspp.）、不動桿菌（Acinetobacterspp.）、芽孢桿菌（Bacillussp.）、假絲酵母（Candida lipolytica）、鏈霉菌（Streptomycesspp.）、紅球菌（Rhodococcusspp.）、無色桿菌（Achromobacterspp.）、短桿菌（Brevibacteriumspp.）、節(jié)桿菌（Arthobacterspp.）等微生物生產(chǎn)生物表面活性劑研究較多[2-10]，但對蒼白桿菌（Ochrobactrum）產(chǎn)生物表面活性劑的研究相對較少。1990年最早分離出的人蒼白桿菌（O.anthropi）利用0.3%酵母浸粉和1%葡萄糖產(chǎn)出對熱穩(wěn)定的生物乳化劑，產(chǎn)物含蛋白組分，對各種烴水混合物有強(qiáng)乳化活性[1]。有的菌株產(chǎn)降低表面張力的脂肽[7]。菌株O.intermediumCN3所產(chǎn)糖脂生物表面活性劑耐熱、高鹽度和pH值，對己烷和廢機(jī)油的乳化活性高達(dá)65%以上，可有效促進(jìn)石油污泥中烴降解[11]。嗜鹽菌株Ochrobactrumsp.BS-206利用丙酮酸鈉和硝酸鈉發(fā)酵生成的生物表面活性劑Ochrosin不僅能降低表面張力和乳化多種烷烴，還具有抗菌、抗粘、拒食和殺蟲活性[12]。菌株O.intermedium將廢棄烴轉(zhuǎn)化為具有高乳化活性的聚羥基丁酸酯（poly hydroxybutyrate，PHB）[13]。菌株O.intermedium的游離細(xì)胞和海藻酸鈣固定化細(xì)胞利用2%十六烷（V/V）和1 g/L NH4NO3，發(fā)酵48 h能降低表面張力至33 mN/m，發(fā)酵72 h乳化活性達(dá)到68%～93%[14]。菌株O.intermediumMZV101能同時生產(chǎn)適于洗滌的耐高溫（70～90 ℃）和堿性（pH9～13）的脂肪酶和生物表面活性劑，產(chǎn)物對重金屬離子、去污劑和有機(jī)溶劑穩(wěn)定，且抑制多種微生物[15]。水牛瘤胃源菌株O.pseudintermediumC1可以利用廢機(jī)油生產(chǎn)胞外多糖生物乳化劑[16]。菌株O.anthropiAD2以酵母浸粉和蛋白糖肽為氮源，利用葡萄糖補(bǔ)加辛烷、輕油、重油和原油能產(chǎn)胞外多糖乳化劑，乳化活性范圍寬，且化學(xué)組成和乳化活性依培養(yǎng)條件而異，但無表面活性劑活性[17]。菌株O.anthropiRIPI5-1[18]以原油為碳源生產(chǎn)生物表面活性劑。菌株O.anthropi2/3以棕櫚油廢渣和味精廢水為碳源和氮源時，最適碳氮比（C/N）為25，而C/N在30～50會抑制糖脂表面活性劑產(chǎn)生[19]。

本實驗室在之前的研究中篩選到生物乳化劑生產(chǎn)菌株，發(fā)現(xiàn)蔗糖比葡萄糖、硝酸鈉比硫酸銨均更能促進(jìn)該菌產(chǎn)生物乳化劑[20-21]。本研究通過對細(xì)胞生長、發(fā)酵液表面張力和乳化活性的分析，進(jìn)一步探討糖碳源、氨基酸氮源以及碳氮比對其生產(chǎn)生物表面活性劑發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

蒼白桿菌（Ochrobactrumsp.）XY-1：本實驗室自行分離、篩選、鑒定、保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L。115 ℃滅菌30 min。

斜面種子培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂。115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO43.4 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母浸粉0.2 g/L。培養(yǎng)基均調(diào)pH至7.0，于115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘油：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、纈氨酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗所用試劑均為分析純試劑或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型精密pH計、722S型分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；JZY-180界面張力儀：河北省承德市材料試驗機(jī)廠；Avanti J-E離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

取斜面保存的Ochrobactrumsp. 菌種一環(huán)接種于斜面種子培養(yǎng)基上，在30 ℃活化培養(yǎng)48 h后，將2環(huán)活化菌體接種于100 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h，得種子液。

1.3.2 發(fā)酵

以8%（V/V）接種量將種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160r/min搖床培養(yǎng)7d，按時取樣測量。發(fā)酵液在4℃、13300×g離心20 min獲得上清液，用于相關(guān)測定。

1.3.3 糖碳源、氨基酸氮源及碳氮比對菌株產(chǎn)生物表面活性劑發(fā)酵的影響

在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加4 g/L硝酸鈉為氮源，分別以10 g/L的木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘油為碳源，研究糖碳源對菌株發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響。以10 g/L蔗糖為碳源，分別以7.35 g/L谷氨酸、6.65 g/L天冬氨酸、3.65 g/L賴氨酸、2.18 g/L精氨酸、5.85 g/L纈氨酸為氮源，研究氨基酸氮源對菌株發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響。以4 g/L硝酸鈉為氮源，分別以質(zhì)量濃度1.57 g/L、15.66 g/L、31.32 g/L、46.98 g/L和62.64 g/L的蔗糖為碳源，使碳氮比（C/N）分別為1、10、20、30和40，研究碳氮比對菌株發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響。

1.3.4 測定方法

菌體密度：采用比濁法測定[22]，以發(fā)酵上清液為空白，以波長600 nm測定的發(fā)酵液光密度值OD600nm表示。

發(fā)酵液pH：使用pH計于室溫條件下（25 ℃）測定。

發(fā)酵液表面張力：采用吊環(huán)法于室溫條件下（25 ℃）測定[23]。

發(fā)酵液乳化活性：取1.5 mL發(fā)酵上清液，與0.9 g液體石蠟于10 mL具塞刻度管中手動搖勻150次，靜置24 h，乳化層高度占液體總高度百分比即為發(fā)酵液乳化活性。

發(fā)酵液總糖含量：采用苯酚-硫酸法測定[24]。

發(fā)酵液還原糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸法測定[25]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有發(fā)酵和測定分別重復(fù)3次，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。由軟件Microsoft Excel 2019進(jìn)行方差分析和獨立樣本T檢驗。當(dāng)P值≤0.05時，有顯著性差異；P值＞0.05時，無顯著差異。采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糖碳源對菌株發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響

由圖1A可知，以不同糖碳源發(fā)酵時，發(fā)酵過程中發(fā)酵液的總糖或甘油濃度均呈下降的趨勢，下降速度依甘油、蔗糖、乳糖、果糖、木糖的順序減小，而總糖殘留量依蔗糖、乳糖、木糖、果糖、甘油的順序減小。由圖1B可知，細(xì)胞生長速度依甘油、蔗糖、乳糖、果糖、木糖的順序減小，最大細(xì)胞生長量依蔗糖、甘油、木糖、果糖、乳糖的順序減小，而最大生長耗時依蔗糖、甘油、木糖、果糖、乳糖的順序增大。菌體生長速度與碳源消耗速度相一致，但碳源消耗量與菌體最大生長量卻不一致。由圖1C可知，在發(fā)酵過程中，不同糖碳源的發(fā)酵液乳化活性升高程度依蔗糖、乳糖、木糖、果糖、甘油的順序減少（依次為56.3%、50%、48%、48%、40%），蔗糖為碳源發(fā)酵的乳化活性（56.3%）顯著高于其他碳源（P＜0.05）；乳化活性升至最高所需發(fā)酵時間依蔗糖、乳糖、木糖、甘油、果糖的順序延長。由圖1D可知，不同糖碳源發(fā)酵液的表面張力下降后均有回升，表面張力下降程度依木糖、乳糖、甘油、蔗糖、果糖的順序減少（依次為51.13 mN/m、54.20 mN/m、55.18 mN/m、57.93 mN/m、58.18 mN/m），差異顯著，表面張力下降至最低所需發(fā)酵時間依蔗糖、乳糖、甘油、木糖、果糖的順序延長。

圖1 不同糖碳源發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑時總糖或甘油（A）、細(xì)胞生長量（B）、乳化活性（C）、表面張力（D）變化Fig. 1 Changes of total sugar or glycerol (A), cell growth amount (B), emusifying activity (C), surface tension (D) when biosurfactant was produced by fermentation with different saccharides carbon sources

結(jié)果表明，實驗菌株可以利用上述碳源生長和代謝，不同碳源發(fā)酵液表面張力下降幅度均較?。ㄐ∮?0 mN/m），所以，實驗菌株發(fā)酵所產(chǎn)表面活性劑降低液體表面張力的活性較低或生成量較少，但能生成較大量或者活性較高的生物乳化劑。蔗糖碳源被直接用于菌體生長和代謝，有利于菌體較快較大量生長且高產(chǎn)生物乳化劑；雖然乳糖碳源的同化作用最差，但有利于合成生物乳化劑和生物表面活性劑。甘油主要被較高效地用于菌體生長和生物表面活性劑合成。利用木糖和果糖生長和生產(chǎn)的水平都較低。木糖和果糖碳源發(fā)酵3 d后發(fā)酵液乳化活性才升高，可能與期間菌體生長較少有關(guān)。甘油碳源發(fā)酵的前2天菌體生長較快，但發(fā)酵液乳化活性卻低于蔗糖和乳糖碳源的發(fā)酵液。說明菌體生長過快和太少均不利于實驗菌株發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性劑。綜上分析，糖碳源以蔗糖為碳源發(fā)酵較為適宜。

2.2 不同氨基酸氮源對菌株發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響

由圖2A、圖2B可知，以不同氨基酸氮源發(fā)酵時，發(fā)酵過程中細(xì)胞生長速度和耗糖速度依天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸的順序減小，細(xì)胞最大生長量依谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸的順序減小，細(xì)胞最大生長量所需時間依谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸的順序延長，而耗糖量依天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸的順序減少。不同氨基酸氮源均在發(fā)酵的前2天菌體快速生長，隨后減慢，只有谷氨酸氮源發(fā)酵仍快速生長，并于發(fā)酵3 d達(dá)最大生長量。由圖2C可知，不同氨基酸氮源的發(fā)酵液乳化活性升高速度依天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸的順序減少；乳化活性升高幅度依天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸的順序減少（依次為54%、49%、24.5%、12%、12%），差異顯著；乳化活性升高至最大所需時間依天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、谷氨酸、纈氨酸的順序減少。以天冬氨酸為氮源發(fā)酵4 d的發(fā)酵液乳化活性最大（54%），隨后下降，可能是由于發(fā)酵液中糖含量過低，致使所產(chǎn)生物表面活性劑被菌體利用。由圖2D可知，不同氨基酸氮源的發(fā)酵液初始表面張力就有差異，依谷氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、賴氨酸、精氨酸的順序減少，在不同發(fā)酵時間的順序有別，下降幅度較小，且彼此差異不顯著。相比硝酸鈉氮源（見2.1），使用天冬氨酸氮源時，菌體生長更快更多，提前1天達(dá)到略低的最大乳化活性，而其他氨基酸氮源的發(fā)酵液乳化活性明顯低。

圖2 不同氨基酸氮源發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑時總糖或甘油（A）、細(xì)胞生長量（B）、乳化活性（C）、表面張力（D）變化Fig. 2 Changes of total sugar or glycerol (A), cell growth amount (B), emusifying activity (C), surface tension (D)when biosurfactant was produced by fermentation with different amino acids nitrogen sources

結(jié)果表明，天冬氨酸氮源發(fā)酵的菌體生長和生物乳化劑生成較快較多，使發(fā)酵耗糖最快最多，與谷氨酸氮源發(fā)酵相比較，其最大細(xì)胞生長量較小，發(fā)酵液乳化活性卻較早升至最高，可見，適當(dāng)限制菌體生長有助于代謝合成生物乳化劑。天冬氨酸氮源發(fā)酵2 d后的菌體生長減慢，可能是大量合成生物乳化劑以及糖含量降低之故。谷氨酸氮源不僅促進(jìn)細(xì)胞生長，還因有助于前體物質(zhì)合成而促進(jìn)生物乳化劑合成，提高細(xì)胞對氮源的利用率[26]，又因較大程度促進(jìn)生長而使發(fā)酵液乳化活性低于天冬氨酸氮源發(fā)酵液。賴氨酸、精氨酸和纈氨酸氮源的菌體生長量較低，不利于產(chǎn)生物乳化劑?？赡芘c相同氮素含量下天冬氨酸和谷氨酸分子含有較多的碳素有關(guān)，還需進(jìn)一步考察。綜上分析，天冬氨酸比其他氨基酸更適于作為生物乳化劑發(fā)酵的氮源，而接近硝酸鈉氮源的發(fā)酵效果。

2.3 不同碳氮比對菌株發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑的影響

由圖3A可知，以不同碳氮比發(fā)酵時，發(fā)酵過程中發(fā)酵液的總糖濃度隨發(fā)酵時間延長而下降，耗糖量隨C/N增大而增大。在本研究的C/N 水平，C/N為1的菌體生長量最小，C/N為30的菌體生長最快最多，明顯比C/N為40的生長快且多（圖3B）。可見，碳源濃度較低會限制生長，較高會抑制生長。如圖3C所示，C/N在10、20和30發(fā)酵4天的發(fā)酵液表現(xiàn)出最大乳化活性（依次為55.75%、54.95%、54.78%），彼此差異不顯著；C/N在1和40的發(fā)酵液乳化活性升高較晚，且顯著低于其他C/N發(fā)酵液的乳化活性（分別為19.73%、46.00%），說明過高和過低的C/N均不利于合成及積累生物乳化劑。不同C/N的發(fā)酵液表面張力均在發(fā)酵2 d降至最低（圖3D，56～59 mN/m），降低幅度很小且無顯著差異，說明生物表面活性劑生產(chǎn)幾乎不受C/N影響，主要由實驗菌株代謝特性決定。C/N為1的菌體生長量以及耗糖均較少；C/N為40耗糖和殘留糖均較多，糖碳源不能有效地用于菌體生長和生成生物乳化劑。C/N在10、20、30的發(fā)酵液乳化活性升高較快較多，且乳化活性較穩(wěn)定，殘?zhí)禽^低，其中C/N為10的發(fā)酵液殘?zhí)羌熬w生長量均較低，乳化活性最大，達(dá)到55.75%，說明產(chǎn)生的還原糖被較快較多地用于合成生物乳化劑。

圖3 不同碳氮比發(fā)酵產(chǎn)生物表面活性劑時總糖或甘油（A）、細(xì)胞生長量（B）、乳化活性（C）、表面張力（D）變化Fig. 3 Changes of total sugar or glycerol (A), cell growth amount (B), emusifying activity (C), surface tension (D) when biosurfactant was produced by fermentation with different carbon and nitrogen ratio

綜上所述，碳氮比過高和過低均不利于菌體生長和生物表面活性劑合成，選擇C/N為10發(fā)酵產(chǎn)生物乳化劑，既利于菌體生長和生物表面活性劑合成，也利于有效利用碳源，降低生產(chǎn)成本。

3 結(jié)論

實驗菌株Ochrobactrumsp. XY-1以4 g/L硝酸鈉為氮源，可以利用10 g/L的蔗糖、乳糖、甘油、木糖、果糖生長并合成生物乳化劑，蔗糖碳源的菌體生長較快較多且高產(chǎn)生物乳化劑，發(fā)酵5 d達(dá)最大乳化活性56.3%；雖然乳糖碳源的菌體生長較差，但有利于合成生物乳化劑和生物表面活性劑。以10 g/L蔗糖碳源并分別以相同氮含量（0.05 mol/L）的谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸和纈氨酸為氮源，也表現(xiàn)出生長和合成生物乳化劑，以天冬氨酸和谷氨酸為氮源較突出，且天冬氨酸比谷氨酸氮源發(fā)酵的細(xì)胞生長量小，發(fā)酵液乳化活性較快（發(fā)酵4 d）升至最高（54%）。使用天冬氨酸氮源比硝酸鈉氮源的菌體生長更快更多，提前1天達(dá)到略低的最大乳化活性。以蔗糖為碳源，在C/N為10的菌體生長較少，但乳化活性達(dá)到最大55.75%。跟同類研究比，本實驗菌株發(fā)酵液的乳化活性不高，發(fā)酵較慢，可以通過優(yōu)化培養(yǎng)條件得以改善。今后應(yīng)進(jìn)一步研究更多水溶性和水不溶性碳源的發(fā)酵特性以及不同碳源和氮源的組合發(fā)酵效果，并對所產(chǎn)生物乳化劑進(jìn)行提取和化學(xué)組成分析，建立構(gòu)效關(guān)系。