駱仲舟，鄧宇晴，王耿媛，黃遠(yuǎn)聰，林偉鋒，袁進(jìn)

(中山大學(xué)中山眼科中心工程中心，廣州 510000)

瞼板腺是人體最大的皮脂腺，埋藏于上下瞼板之中，其開(kāi)口位于瞼緣，從眼瞼邊緣垂直穿過(guò)后眼瞼至瞼板的相對(duì)邊緣。瞼板腺的功能是合成、儲(chǔ)存并分泌多種脂質(zhì)，所分泌的脂質(zhì)能構(gòu)成淚膜的脂質(zhì)層，直接影響淚液蒸發(fā)及淚膜的穩(wěn)定性，具有重要的生理功能[1-2]。瞼板腺的功能與其形態(tài)相關(guān)，炎癥、堵塞、激素水平變化、環(huán)境因素等多種原因均可以影響瞼板腺的數(shù)量和形態(tài)，進(jìn)而改變瞼板腺油脂分泌功能，導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降，發(fā)生瞼板腺功能障礙(meibomian gland disease，MGD)。

MGD是蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼癥的最常見(jiàn)的病因[3]。蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼癥約占據(jù)干眼構(gòu)成的86%，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重和慢性的癥狀以及繼發(fā)性結(jié)膜和角膜的改變，是一種困擾人們視覺(jué)質(zhì)量乃至生活質(zhì)量的常見(jiàn)病[4]。因此，瞼板腺腺體的扭曲、膨大、萎縮乃至缺失是MGD診斷的重要特異性體征[5]。

目前，在臨床上通過(guò)瞼板腺紅外成像技術(shù)使得眼科醫(yī)生能直接觀察到瞼板腺腺體結(jié)構(gòu)，可對(duì)腺體萎縮和丟失情況進(jìn)行粗略評(píng)估[6]。但如何對(duì)上述腺體形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行量化分析，值得深入研究。2012年，Srinivasan等[7]發(fā)表了一種利用ImageJ Software (National Institute of Health；http://imagej.nih.gov/ij)計(jì)算MGD患者的瞼板腺缺失率的方法，該方法是用ImageJ軟件的自由選擇工具勾畫(huà)出瞼板腺缺失的面積進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算MGD患者瞼板腺缺失的面積與整個(gè)瞼板腺的面積的關(guān)系，并用百分比表示瞼板腺缺失率。然而，使用該軟件用戶(hù)必須手動(dòng)定義每個(gè)患者腺體區(qū)域。不同的操作者可能會(huì)畫(huà)出不同的腺體區(qū)域，導(dǎo)致結(jié)果存在一定的差異。2013年，Arita等[8]對(duì)瞼板腺圖片自動(dòng)確定測(cè)量區(qū)域，并對(duì)上眼瞼各瞼板腺的輪廓進(jìn)行分析。這種方法由于只分析瞼板腺本身的輪廓，而沒(méi)有計(jì)算瞼板腺的面積[8]，雖對(duì)分析瞼板腺細(xì)微變化有利，但沒(méi)能客觀的表現(xiàn)瞼板腺缺失的程度。在針對(duì)基于紅外成像技術(shù)的瞼板腺圖片和瞼板腺的生物參數(shù)，既要準(zhǔn)確分析瞼板腺腺體的形態(tài)生物參數(shù)和精確計(jì)算瞼板腺缺失的百分比，本文章自主研發(fā)了瞼板腺腺體自動(dòng)分析軟件(Meibomian Gland Bio-image Analyzer V3)，并首次將該技術(shù)用于計(jì)算瞼板腺腺體長(zhǎng)度、寬窄、面積百分、形變系數(shù)及顯影值等生物參數(shù)。精確的瞼板腺量化分析系統(tǒng)，可有效幫助MGD的臨床診斷及分級(jí)。

1 材料與方法

1.1 基于紅外成像原理的瞼板腺圖像

本項(xiàng)目使用的紅外成像設(shè)備是Oculus Keratograph 5M，是德國(guó)Oculus公司的眼表綜合分析儀設(shè)備，其瞼板腺拍攝功能是通過(guò)紅外透射瞼板腺拍攝，具有增強(qiáng)對(duì)比模式，重點(diǎn)突出腺體，更易于辨認(rèn)。其設(shè)備采用的是數(shù)碼CCD照相機(jī)，其分辨率為1 360×1 024像素，經(jīng)過(guò)增強(qiáng)對(duì)比模式后，高清瞼板腺圖像分辨率為1 088×512像素。工作距離100 mm，使用中心波長(zhǎng)為830 nm的紅外光源。使用低反射柵格測(cè)試板(Edmund #62-949，2×2英寸，0.0625 mm點(diǎn)直徑，0.125 mm點(diǎn)間距)測(cè)量出，1個(gè)像素表示實(shí)際尺寸為0.025 mm ×0.025 mm。

1.2 瞼板腺圖像分析系統(tǒng)

瞼板腺圖像量化分析分析系統(tǒng)是基于LabVIEW 2016(National Instruments Corporation，US)和NI視覺(jué)模塊開(kāi)發(fā)，操作系統(tǒng)為Windows 7及更高版本。系統(tǒng)分為圖像識(shí)別，圖像預(yù)處理和生物參數(shù)分析3大模塊。圖1所示為一例完整的瞼板腺圖像量化分析系統(tǒng)界面圖。

1.2.1 瞼板腺圖像識(shí)別

由于Oculus Keratograph 5M(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為K5)所導(dǎo)出圖像的方式是通過(guò)截取屏幕，每個(gè)設(shè)備使用的分辨率，軟件版本并非統(tǒng)一，因此增強(qiáng)對(duì)比模式的瞼板腺圖像在導(dǎo)出的圖像上位置不是固定的。針對(duì)K5所導(dǎo)出的圖像(圖2)，系統(tǒng)需要自動(dòng)識(shí)別增強(qiáng)對(duì)比模式的瞼板腺圖像。根據(jù)導(dǎo)出圖像的灰度差和圖片位置，可以發(fā)現(xiàn)所需要識(shí)別的增強(qiáng)對(duì)比模式的瞼板腺圖像相對(duì)邊框較暗(灰度值較低)且位置在圖像中心點(diǎn)的左上方。因此第1步需要對(duì)圖像進(jìn)行分塊處理；第2步根據(jù)位置的選擇需要識(shí)別的區(qū)域，通過(guò)Graham算法[9]截取有效圖像(圖2D)。

1.2.2 瞼板腺圖像預(yù)處理

使用K 5 的增強(qiáng)對(duì)比模式來(lái)攝取圖像，自動(dòng)把采集的瞼板腺圖像增強(qiáng)了瞼板腺和眼瞼的對(duì)比度，通過(guò)識(shí)別得到分辨率為1 088×512像素的高清瞼板腺圖像。但K5設(shè)備雖把瞼板腺和眼瞼的對(duì)比度增強(qiáng)，更容易觀測(cè)，但仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分割，有效提取瞼板腺腺體。因此，需要對(duì)瞼板腺圖像進(jìn)行圖像預(yù)處理，自動(dòng)提取出腺體輪廓。圖像預(yù)處理核心算法部分是基于圖像算法Convolution和Morphology算法改寫(xiě)，結(jié)合形態(tài)濾波及Convex Hull算法，其實(shí)現(xiàn)步驟如下。

步驟一：由于瞼板腺和眼瞼的平均灰度為190和140，而眼睫毛和高亮發(fā)光點(diǎn)平均灰度為20和250，因此利用灰度差，通過(guò)控制二值化的閾值和邊緣檢測(cè)，快速識(shí)別瞼板腺的眼睫毛，高亮反光點(diǎn)和瞼板腺的輪廓，再使用形態(tài)學(xué)濾波，可以去除這兩部分的圖像信息。

其中形態(tài)濾波方式如下：A為原圖矩陣，B為結(jié)構(gòu)矩陣，R為處理后矩陣。

步驟二：去除眼瞼毛和高反光點(diǎn)后，容易精準(zhǔn)識(shí)別出瞼板腺的輪廓，通過(guò)對(duì)Convolution和Morphology改寫(xiě)算法，結(jié)合形態(tài)學(xué)濾波和Convex Hull算法[10]，去除無(wú)效邊緣信息，得到僅剩瞼板腺的圖像。

改寫(xiě)算法核心如下，f為原圖矩陣，b為結(jié)構(gòu)矩陣，h為核矩陣，G為處理后矩陣：

圖1 瞼板腺圖像量化分析系統(tǒng)界面圖Figure 1 The interface of Meibomian gland image quantitative analysis system

圖2 圖像分塊與識(shí)別圖像處理圖Figure 2 The figure of the image segmentation and recognition image processing

其中公式[2]、公式[3]中，Df和Db分別表示圖像輸入矩陣f(x,y)和結(jié)構(gòu)矩陣b(x,y)的定義域。公式[4]中，Dh表示核矩陣h(x,y)的定義域。

步驟三：得到瞼板腺圖像后，進(jìn)行圖像處理重建，增強(qiáng)腺體的對(duì)比度，分割腺體與眼瞼，自動(dòng)提取腺體形態(tài)。其中f為原圖矩陣，k為結(jié)構(gòu)矩陣，M為處理后矩陣；

步驟效果圖如圖3所示。

通過(guò)上述的方法可以在圖像預(yù)處理的步驟中實(shí)現(xiàn)瞼板腺區(qū)域與腺體的自動(dòng)提取。但考慮到實(shí)驗(yàn)中仍有部分圖片無(wú)法自動(dòng)提取，軟件同時(shí)也開(kāi)放了手動(dòng)勾畫(huà)的模式，操作者可以使用手動(dòng)勾畫(huà)的方式把瞼板腺的區(qū)域勾畫(huà)出來(lái)，系統(tǒng)再根據(jù)所勾畫(huà)的區(qū)域提取出瞼板腺區(qū)域和腺體。

1.2.3 瞼板腺的生物參數(shù)

瞼板腺形態(tài)與其功能相關(guān)，炎癥、堵塞、激素水平變化、環(huán)境因素等多種原因均可以影響瞼板腺的數(shù)量和形態(tài)，進(jìn)而改變瞼板腺油脂分泌功能，導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降，發(fā)生MGD。因此瞼板腺腺體扭曲、膨大、萎縮乃至缺失是MGD診斷的重要特異性體征。

根據(jù)腺體的形態(tài)，可以計(jì)算腺體的長(zhǎng)度、直徑、面積、形變系數(shù)(deformation coefficient，DC)、顯影值和中央腺體的腺體百分比6個(gè)生物參數(shù)。通過(guò)檢測(cè)腺體的邊緣，從上到下，每4個(gè)像素1個(gè)步進(jìn)計(jì)算掃描腺體，計(jì)算腺體兩邊界點(diǎn)A，B的坐標(biāo)。通過(guò)對(duì)點(diǎn)A，B的計(jì)算，計(jì)算出生物參數(shù)。計(jì)算公式如下：

圖3 瞼板腺圖片預(yù)處理過(guò)程圖Figure 3 The figure of the meibomian gland image preprocessing process

其中，x，y分別表示像素矩陣的橫縱坐標(biāo)，i為二值化像素值。

瞼板腺異常輕中度患者，腺體普遍存在扭曲和變形，形變系數(shù)是腺體的形體參數(shù)。根據(jù)臨床上腺體的病理性改變，基于弧弦比模型，建立形變系數(shù)生物參數(shù)。腺體的變異程度量化分析可進(jìn)一步指導(dǎo)患者病情分級(jí)，同時(shí)可為進(jìn)行個(gè)體精準(zhǔn)化治療提供評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

其中P為腺體單邊周長(zhǎng)：

通過(guò)對(duì)形變系數(shù)的比較(圖4)，越趨于正常的腺體，形變系數(shù)越小，腺體的扭曲和堵塞都會(huì)影響形變系數(shù)。

從解剖結(jié)構(gòu)上看，瞼板腺由腺體導(dǎo)管和腺泡組成，大大小小的腺泡依附在腺體導(dǎo)管的周?chē)倥莶煌５胤置谝环N油脂和蛋白的混合物，通過(guò)腺體導(dǎo)管不斷往外排出，最終到達(dá)眼瞼的開(kāi)口處[11]。混合物隨著每一次的眨眼動(dòng)作，在淚液表面自由擴(kuò)散，涂抹在淚膜的表面，形成脂質(zhì)層。作為淚膜表面的活性劑，構(gòu)成一個(gè)淚膜屏障，使淚膜的蒸發(fā)減慢。當(dāng)脂質(zhì)層的穩(wěn)定性下降，淚膜蒸發(fā)加快，維持時(shí)間短，可導(dǎo)致蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼癥。因此，通過(guò)顯影值來(lái)表示瞼板腺中腺泡的含量。

在同一的照明條件下，不同組織吸收光線(xiàn)的數(shù)值叫做光密度(optical density，OD)。利用攝像機(jī)采集光信號(hào)通過(guò)光電轉(zhuǎn)換原理，在圖像中以灰度值來(lái)表示，測(cè)量目標(biāo)吸收的光線(xiàn)越多，光密度數(shù)值越大[12]。當(dāng)光線(xiàn)照射一個(gè)密度均勻的物質(zhì)時(shí)，被吸收光能量的多少與該物質(zhì)的含量成正比，而與照射光的強(qiáng)度無(wú)關(guān)[13]。因此，光密度可以用來(lái)衡量瞼板腺中脂質(zhì)的含量。以光密度為模型，定義瞼板腺的顯影值，表示腺體的脂質(zhì)含量。

顯影值公示如下：

圖4 腺體的生物參數(shù)模型與分析對(duì)照?qǐng)DFigure 4 Comparison diagram of the biological parameter model and analysis of the gland

圖5 腺體的顯影值分析對(duì)照?qǐng)DFigure 5 Contrast figure for development of the glands

在臨床工作中，評(píng)估患者的腺體情況以中央5～8條腺體為主，且瞼板腺檢查中以中央分腺體最為清晰，中央腺體百分比及長(zhǎng)度評(píng)估結(jié)果可代表患者主要腺體的功能情況，直徑可部分反映腺體的阻塞程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。重復(fù)性評(píng)估為同一圖像來(lái)源不同操作者的2次測(cè)量值，采用重復(fù)觀察平均差異()、變異系數(shù)(coefficient of variation，CV%)及組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass corr elation coefficient，ICC)表示，CV%＜10%時(shí)重復(fù)性較好，統(tǒng)計(jì)學(xué)上認(rèn)為ICC＞0.75時(shí)具有良好的復(fù)測(cè)可信度。兩次分析結(jié)果差異用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由中山眼科中心招募正常受試者24 人(42 眼)，年齡(34±8)歲，其中，男性受試者10人，女性受試者14人。采用Oculus Keratograph 5M進(jìn)行瞼板腺紅外攝影。其中選取受試者中的10人(20眼)在同型號(hào)的設(shè)備上由兩名已接受培訓(xùn)的操作員分別行瞼板腺紅外攝影，所拍攝的圖像數(shù)據(jù)通過(guò)瞼板腺分析系統(tǒng)(Meibomian Gland Bioimage Analyzer V3)進(jìn)行生物參數(shù)分析。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)手動(dòng)選擇上瞼結(jié)膜中央5條腺體進(jìn)行形態(tài)學(xué)參數(shù)的定量分析，對(duì)有2名操作員所拍攝的數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，分析其數(shù)據(jù)在眼表疾病中的診斷價(jià)值。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)對(duì)24位受試者(42眼)的瞼板腺圖像進(jìn)行分析，瞼板腺生物參數(shù)測(cè)量均值：腺體平均直徑為(0.48±0.09) mm，腺體平均長(zhǎng)度為(5.25±0.68) mm，腺體平均面積為(2.12±0.53) mm，腺體形變系數(shù)分別為10.01±3.85，顯影值為6.32±1.23，中央5條腺體占中央?yún)^(qū)域面積百分比為(10.94±2.20)%，腺體占上瞼結(jié)膜面積百分比為(58.07±8.13)%。

選取受試者中的10 人(20眼)在同型號(hào)的設(shè)備上由第2 名操作員進(jìn)行第2 次瞼板腺紅外攝影進(jìn)行重復(fù)性的校驗(yàn)評(píng)估，通過(guò)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)的方法得出結(jié)果。所有指標(biāo)的P值均大于0.05，CV均小于5%，ICC均大于0.95。兩次分析的各生物參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重復(fù)性較好，可信度高。

3 討論

本文介紹了一種高效的、客觀的量化分析軟件及瞼板腺綜合分析系統(tǒng)，可用于快速識(shí)別瞼板腺的區(qū)域并自動(dòng)提取瞼板腺的紅外成像中的腺體，自動(dòng)計(jì)算中央每條腺體的長(zhǎng)度、直徑、面積、形變系數(shù)和顯影值，并提供中央?yún)^(qū)域腺體的百分比。還可以手動(dòng)勾選特定腺體區(qū)域進(jìn)行定位隨訪(fǎng)追蹤，為臨床提供了多個(gè)生物參數(shù)，更客觀、更高效、更精準(zhǔn)地展現(xiàn)瞼板腺形態(tài)學(xué)的變化以及瞼板腺缺失的情況。本研究表明：隨著腺體的迂曲和堵塞的變化，變異系數(shù)有明顯差異，腺體越趨于正常，變異系數(shù)越小。在同一光源照射下，顯影值高為脂質(zhì)含量高，分泌脂質(zhì)功能好；而顯影值低為脂質(zhì)含量低，分泌脂質(zhì)功能差。顯影值不受瞼板腺圖像的整體光亮度影響，但會(huì)受到局部反光的影響。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于部分測(cè)試者對(duì)翻眼瞼的不適用，瞼板腺圖像位置不對(duì)，反光不均勻和眼瞼暴露不完整，這會(huì)導(dǎo)致瞼板腺圖像導(dǎo)入系統(tǒng)后會(huì)提取不精準(zhǔn)，小部分的干擾信息無(wú)法去除。另外當(dāng)測(cè)試者瞼板腺?lài)?yán)重缺失的，由于缺失的大區(qū)域在光源照射下，偶爾會(huì)有不同程度的高反光，這會(huì)導(dǎo)致瞼板腺圖像導(dǎo)入后，系統(tǒng)會(huì)判斷為腺體，屬于無(wú)法去除的干擾項(xiàng)。以上兩點(diǎn)還需要通過(guò)對(duì)圖像算法的優(yōu)化和提高，進(jìn)一步提高系統(tǒng)對(duì)干擾項(xiàng)的處理能力，增加系統(tǒng)的精確度。

目前中國(guó)有近3億干眼患者，臨床檢查需求量巨大，將瞼板腺綜合分析系統(tǒng)植入到干眼篩查檢查項(xiàng)目中，有望為臨床上對(duì)瞼板腺腺體功能評(píng)估提供新的非侵入性參考指標(biāo)，進(jìn)一步幫助醫(yī)生進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的診斷及療效評(píng)估。