范先煜，汪碩聞，范國(guó)榮

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 200080)

氟尿嘧啶(5-FU)是一種廣譜、細(xì)胞毒性抗腫瘤藥，常單獨(dú)或與其他化療藥物聯(lián)合使用，是治療頭頸部癌、胰腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌的重要藥物。5-FU的治療窗窄，體內(nèi)濃度個(gè)體間差異大，因此5-FU的臨床療效和藥品不良反應(yīng)(ADRs)在不同患者間也具有很大差異。研究發(fā)現(xiàn)，基于體表面積給藥的多數(shù)患者都沒有達(dá)到最佳的藥物暴露。許多研究已指出，根據(jù)5-FU的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)調(diào)整劑量可通過降低毒性和提高療效顯著改善臨床結(jié)局[1-2]。

體內(nèi)約80%的5-FU通過二氫嘧啶脫氫酶(DPD)快速代謝成無活性的代謝產(chǎn)物，DPD的活性存在個(gè)體差異，活性下降可導(dǎo)致5-FU的清除受阻[2]。由于DPD也是體內(nèi)尿嘧啶(U)代謝為二氫尿嘧啶(UH2)的關(guān)鍵酶，酶活性缺失會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的減少，因此可通過化療前測(cè)定血漿中UH2與U血藥濃度比值(UH2/U)，間接反映DPD活性大小，用于預(yù)測(cè)患者給藥后可能發(fā)生的毒性反應(yīng)[3]。相比用藥物遺傳學(xué)方法篩查基因多態(tài)性，測(cè)定UH2/U具有更高的靈敏度[4]，且節(jié)省檢測(cè)時(shí)間和成本[5]，能夠可靠地反映酶活性的缺失。

為了盡可能降低毒副反應(yīng)的發(fā)生，臨床上可通過UH2/U預(yù)測(cè)5-FU首輪治療的劑量，再根據(jù)5-FU的血藥濃度調(diào)整后續(xù)劑量。因此，建立一種同時(shí)檢測(cè)血漿中5-FU、U和UH2濃度的分析方法，對(duì)5-FU用藥方案的優(yōu)化有重要意義。國(guó)內(nèi)的報(bào)道多采用HPLC法測(cè)定5-FU[6]或UH2和U[7]，但由于這類化合物極性大，血漿中其他內(nèi)源性物質(zhì)易對(duì)分析造成干擾，且有定量下限較高、分析時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)尚無基于LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中5-FU、U和UH2濃度的報(bào)道。本研究建立了LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中這3種物質(zhì)，并應(yīng)用于消化道腫瘤患者的治療藥物監(jiān)測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材 料

1.1 儀器 LC-20A液相色譜儀、8040三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)；MS-X可調(diào)式渦旋振蕩儀(美國(guó)賽洛捷克公司)；Sorvall Legend Micro 21R微量離心機(jī)[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；CPA225D十萬分之一電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；VapAuto S60 多樣品自動(dòng)濃縮儀(美國(guó)ATR公司)。

1.2 試藥 5-FU對(duì)照品(純度>99%，批號(hào)M0701AS)、U對(duì)照品(純度>99%，批號(hào)J0803AS)、UH2對(duì)照品(純度>97%，批號(hào)D0104A)、溴尿嘧啶(BU)對(duì)照品(純度>98%，批號(hào)F0129AO)均購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；甲醇(色譜純)、異丙醇(分析純，德國(guó)Merck公司)；甲酸、乙酸乙酯(分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司)；二氯甲烷(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)所用去離子水由Research UV超純水機(jī)(上海和泰儀器有限公司)制得。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Atlantis T3色譜柱(100 mm×3.0 mm,3 μm)，流動(dòng)相為：0.1%甲酸水溶液(V/V，A相)-甲醇(B相)，洗脫梯度(0～2.0 min，5%B；2.0～2.1 min，5%～40%B；2.1～5.0 min，40%B；5.0～5.1 min，40%～5%B；5.1～7.0 min，5%B)，流速0.35 ml/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

2.2 質(zhì)譜條件 使用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行分析，并以正離子模式檢測(cè)UH2和U，用負(fù)離子模式檢測(cè)5-FU和內(nèi)標(biāo)BU。表1和圖1分別為化合物的離子對(duì)和質(zhì)譜特征性參數(shù)及二級(jí)質(zhì)譜圖。

表1 各待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的離子對(duì)和質(zhì)譜特征性參數(shù)Table 1 The characteristic parameters of ion pair and mass spectrum of each analyte and internal standard

圖1 氟尿嘧啶、二氫尿嘧啶、尿嘧啶和內(nèi)標(biāo)溴尿嘧啶的二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 1 Secondary mass spectrum chromatograms of fluorouracil,dihydrouracil,uracil and internal standard bromouracilA:氟尿嘧啶;B:二氫尿嘧啶;C:尿嘧啶;D:溴尿嘧啶

2.3 溶液配制 分別精密稱取5-FU、UH2、U、BU對(duì)照品10.00 mg，置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并定容，得到濃度為1.0 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。其中，5-FU、UH2和U的對(duì)照品稱取兩份，分別配制標(biāo)準(zhǔn)曲線和用于質(zhì)控的對(duì)照品儲(chǔ)備液與工作溶液。對(duì)照品儲(chǔ)備液用50%甲醇逐級(jí)稀釋得系列工作溶液：5-FU和UH2的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液濃度分別為100、200、500、1000、2500、5000、10 000 ng/ml，U的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液濃度分別為50、100、250、500、1250、2500、5000 ng/ml。5-FU和UH2定量下限，低、中、高濃度的質(zhì)控工作液濃度分別為100、250、2000和8000 ng/ml，U為50、125、1000和4000 ng/ml。內(nèi)標(biāo)BU工作液的濃度為3.3 μg/ml。對(duì)照品儲(chǔ)備液和工作溶液均置于-20 ℃保存待用。

2.4 血樣前處理 采用液-液萃取的方法對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理。于200 μl血漿樣品中加入10 μl BU內(nèi)標(biāo)溶液(3.3 μg/ml)，渦旋30 s后，再加入1 ml乙酸乙酯-異丙醇(85∶15，V/V)作為萃取劑，充分渦旋5 min，以1.62×104×g離心10 min(4 ℃)后，取900 μl上層有機(jī)溶液轉(zhuǎn)移入新離心管中，并于35 ℃的溫和氮?dú)饬飨麓蹈蓾饪s。獲得的干燥殘?jiān)?0 μl 5%(V/V)的甲醇-水溶液和10 μl二氯甲烷復(fù)溶，以1.62×104×g離心10 min(4 ℃)，將40 μl上清液轉(zhuǎn)移入進(jìn)樣小瓶中用于分析。

2.5 樣品采集 分別于化療前和5-FU靜脈滴注后22 h采集患者全血5 ml，收集于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的采血管中，立即分離血漿。對(duì)患者的血藥濃度監(jiān)測(cè)經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證 根據(jù)2015版《中華人民共和國(guó)藥典》四部“生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”[8]，對(duì)本研究建立的分析方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

2.6.1 方法專屬性 選取6批不同來源的空白血漿與定量下限樣品比較以評(píng)價(jià)方法的專屬性，典型圖譜見圖2，5-FU及內(nèi)標(biāo)BU均無內(nèi)源性干擾。對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)U和UH2專屬性的評(píng)估通過配制75 mg/ml牛血清白蛋白溶液作為替代基質(zhì)以反映定量下限(LLOQ)樣品實(shí)際的響應(yīng)[9]。5-FU、UH2、U和BU在血漿中的保留時(shí)間分別為2.70、2.27、2.40和4.90 min，均分離良好。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取2.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液與內(nèi)標(biāo)溶液，加入空白血漿中，進(jìn)樣分析。使用峰面積比(分析物/內(nèi)標(biāo)，y)相對(duì)于濃度(x)作最小二乘法回歸分析得到線性方程，并以1/x2作為權(quán)重因子，得到5-FU的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y1=0.003 430x1-0.001 090(r=0.999)；UH2的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y2=0.009 761x2+0.000 200 1(r=0.997)；U的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y3=0.033 83x3-0.013 77(r=0.999)，表明5-FU和UH2在10～1000 ng/ml，U在5～500 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性良好。在計(jì)算UH2和U的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程時(shí)，以空白血漿中UH2或U與內(nèi)標(biāo)BU的峰面積比作為本底值，將標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的UH2或U與內(nèi)標(biāo)的峰面積比減去本底值，從而得到濃度與實(shí)際峰面積的對(duì)應(yīng)關(guān)系[9]。

圖2 氟尿嘧啶、二氫尿嘧啶、尿嘧啶及內(nèi)標(biāo)溴尿嘧啶的LC-MS/MS譜圖Figure 2 LC-MS/MS chromatograms of fluorouracil,dihydrouracil,uracil and internal standard bromouracilA：健康志愿者空白血漿；B：腫瘤患者空白血漿；C：定量下限樣品；D：腫瘤患者實(shí)測(cè)血樣

2.6.3 準(zhǔn)確度和精密度 通過將3批質(zhì)控樣品與隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，考察日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度，其中準(zhǔn)確度用回代標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算得到的理論濃度與實(shí)際濃度間的相對(duì)誤差(RE)表示，精密度用RSD表示。結(jié)果見表2，RE均在88.32%～111.93%，RSD均<8.00%(n=5)，表明本方法準(zhǔn)確度和精密度均符合要求。

表2 LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中氟尿嘧啶、尿嘧啶和二氫尿嘧啶的精密度和準(zhǔn)確度Table 2 Accuracy and precision of fluorouracil,uracil and dihydrouracil in human plasma (n=5)

2.6.4 穩(wěn)定性 考察血漿樣品室溫放置2 h、凍融循環(huán)3次(-40 ℃)、于-80 ℃放置30 d和于自動(dòng)進(jìn)樣盤放置24 h(室溫)的穩(wěn)定性。將放置后的低、中、高3個(gè)濃度(UH2、5-FU濃度分別為25、200、800 ng/ml，U濃度分別為12.5、100、400 ng/ml)的質(zhì)控樣品進(jìn)樣分析，并與新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液算得的線性方程進(jìn)行比較，結(jié)果在上述條件下RE均<108.7%(n=5)，表明人血漿中的5-FU、UH2和U穩(wěn)定性良好。

2.6.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 將按2.4項(xiàng)下方法提取的低、中、高三個(gè)濃度的樣品與對(duì)應(yīng)濃度的純?nèi)芤罕容^，計(jì)算提取回收率，結(jié)果UH2和U的回收率相對(duì)較低，分別為48.10%和60.06%，但在較低的回收率下仍可達(dá)到定量下限，并且不降低分析方法的可靠性。BU的回收率>120%，原因可能是基質(zhì)增強(qiáng)的影響。

在經(jīng)液-液萃取的空白基質(zhì)(不同來源的6批樣品)中標(biāo)準(zhǔn)添加純?nèi)芤?，使?jié)舛扰c低、高濃度質(zhì)控樣品相同，并與相應(yīng)濃度純?nèi)芤罕容^，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(MF)。結(jié)果5-FU、UH2和U的MF均在100.03%～106.87%，且RSD均≤8.58%(n=3)，提示血漿對(duì)各化合物沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，且不同批次的基質(zhì)間無明顯區(qū)別。BU的MF為118.88%，顯示微弱的基質(zhì)增強(qiáng)，可以解釋提取回收率的同步偏大。

2.7 臨床應(yīng)用 收集本院使用5-FU治療的結(jié)直腸癌和胃癌患者共9例，其中男性7例，女性2例，平均年齡65歲。9例患者5-FU的穩(wěn)態(tài)血藥濃度為(402.53±176.33)ng/ml，中位血藥濃度為416.50 ng/ml (174.66～634.95 ng/ml)。化療前患者血漿中U的濃度為(35.03±25.55) ng/ml， UH2的濃度為(211.42±119.64) ng/ml， UH2/U為7.33±3.43。5-FU開始滴注后22 h，U的濃度為(67.41±29.44) ng/ml，UH2的濃度為(300.42±119.64) ng/ml，UH2/U為5.10±2.20?；颊叩幕拘畔?、用藥劑量及5-FU血藥濃度等見表3和圖3。由圖3可見，5-FU給藥后，U和UH2的血藥濃度均較給藥前上升，其中U的變化具有顯著性差異(P=0.02)；UH2/U較給藥前顯著下降(P=0.02)，提示U轉(zhuǎn)化為UH2的過程受5-FU的影響。

3 討 論

3.1 LC-MS/MS法的優(yōu)化

由于5-FU、UH2、U具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)且極性較大，因此獲得良好的分離度、峰型及色譜柱上的保留是優(yōu)化分析方法時(shí)的難點(diǎn)。選擇可承受高水相條件的色譜柱用于分離，預(yù)實(shí)驗(yàn)中比較了Agilent ZORBAX AQ色譜柱和Waters Atlantis T3色譜柱，結(jié)果表明后者具有更好的保留性能和峰型。以往文獻(xiàn)常見用負(fù)離子模式檢測(cè)UH2和U[10]，在預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中則發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用正離子模式電離時(shí)，UH2和U的響應(yīng)相比負(fù)離子模式明顯增加；而5-FU和BU則使用負(fù)離子模式電離，正負(fù)離子通道間快速切換的效率可以保證峰形和響應(yīng)均不受影響。由于BU為人體內(nèi)不含有的外源類似物，不會(huì)在實(shí)測(cè)過程中造成干擾，因此選用BU作為內(nèi)標(biāo)。

表3 9名患者的基本信息、用藥劑量、氟尿嘧啶血藥濃度及二氫尿嘧啶與尿嘧啶血漿濃度比值Table 3 Basic information,dosage,concentration of fluorouracil and the ratio of plasma concentration of dihydrouracil to uracil in the 9 patients

圖3 氟尿嘧啶給藥前后尿嘧啶、二氫尿嘧啶的血漿濃度及二氫尿嘧啶與尿嘧啶血漿濃度比值的變化Figure 3 Changes in plasma concentrations of uracil and dihydrouracil in plasma and the ratio of plasma concentration of dihydrouracil to uracilbefore and after administration of fluorauracil○：尿嘧啶；●：二氫尿嘧啶；△：二氫尿嘧啶與尿嘧啶血漿濃度比值；*P<0.05，給藥前后比較

3.2 血樣前處理方法的優(yōu)化 在血樣前處理方法的優(yōu)化中，分別考察了蛋白沉淀、液-液萃取和固相萃取。據(jù)文獻(xiàn)中的前處理步驟[11]，血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白，上清吹干后再復(fù)溶，但是由于上清中含有一定比例的水，吹干效率較差。由于5-FU相對(duì)分子質(zhì)量小、極性大，在固相載體上難以保留且容易直接被水相洗脫而損失，導(dǎo)致提取回收率低，因此不適合用固相萃取的方法進(jìn)行前處理。參考文獻(xiàn)報(bào)道[10]，使用乙酸乙酯-異丙醇(85∶15，V/V)作為液-液萃取劑，可同時(shí)提取血漿中的5-FU、UH2和U，操作過程簡(jiǎn)便，效率較高，且提取回收率滿足臨床檢測(cè)的要求。

3.3 臨床應(yīng)用 有研究表明，5-FU長(zhǎng)時(shí)間輸注時(shí)，可以用穩(wěn)態(tài)血藥濃度代替血藥濃度曲線下面積(AUC)預(yù)測(cè)ADRs的發(fā)生[12]。5-FU靜脈持續(xù)滴注給藥時(shí)，2 h左右可達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度，在22 h后血藥濃度差異較小[2]。因此，本研究取5-FU持續(xù)靜脈滴注22 h的血樣檢測(cè)5-FU穩(wěn)態(tài)血藥濃度。結(jié)果表明，患者間5-FU血藥濃度的差異較大，其原因可能包括藥物代謝酶的基因差異、身體狀況、食物和藥物之間的相互作用等[2]。研究顯示，直接檢測(cè)細(xì)胞中DPD的活性，其結(jié)果與5-FU的血漿水平相關(guān)性較弱，且較費(fèi)時(shí)費(fèi)力[5]，因此，化療前測(cè)定UH2/U，可作為間接指標(biāo)幫助判斷DPD活性缺陷，從而預(yù)測(cè)毒性[13]，且UH2/U=4為發(fā)生毒性反應(yīng)的臨界值[3]。在本研究測(cè)得的結(jié)果中，9例患者間UH2/U差異較大，有2例患者的UH2/U<4，其中1例發(fā)生3度腹瀉，可能與5-FU代謝遲緩有關(guān)?；颊呤褂?-FU后，UH2/U平均下降約30%，可能是因?yàn)?-FU在體內(nèi)通過DPD代謝為無活性產(chǎn)物，從而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用。因此DPD活性較差的患者須注意5-FU在體內(nèi)消除受阻，易引起蓄積而發(fā)生ADRs。也有研究表明，測(cè)定5-FU給藥期間的UH2/U可以得到更好的預(yù)測(cè)結(jié)果[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，一些具有較高UH2/U的患者也有較高的5-FU血藥濃度，提示僅考察DPD活性對(duì)于預(yù)測(cè)5-FU的暴露和代謝情況并不夠，因此需要結(jié)合5-FU的血藥濃度檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)個(gè)體化用藥。由于本研究納入的病例數(shù)較少，血藥濃度測(cè)定結(jié)果波動(dòng)較大，在下一階段應(yīng)擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究分析。