鐘楠蝶, 李登飛, 楊有芹, 魏麗君, 王瓊*

1. 西華師范大學西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637000；

2. 西華師范大學生命科學學院，四川 南充 637000；

3. 華中師范大學生命科學學院，湖北 武漢 430079

傳粉過程是研究花部特征和傳粉者關(guān)系的紐帶，進而也為研究花部特征進化提供了契機[1]。傳粉昆蟲往往會對某一色系的花產(chǎn)生偏愛[2,3]，花色也成為植物吸引傳粉者重要“廣告特征”之一[4,5]。由于傳粉者不能在距離花朵0.4 m以外分辨出是否有報酬，因此開花植物往往通過花色近距離吸引傳粉者，即傳粉者對顏色的偏好則在近距離內(nèi)發(fā)生選擇性作用[5]。盜蜜是指訪花者直接在蜜距或是花冠上打洞，不進行授粉僅取食花蜜的行為，是影響植物與傳粉者互利共生關(guān)系關(guān)鍵的生物因素之一[6,7]。在動植物的相互關(guān)系中，盜蜜被認為是一種不同于普通傳粉者的不正常的訪花行為，盜蜜者除了作為似盜蜜傳粉的正效應之外，還可能改變對正常傳粉者的訪花行為[8]。一些研究結(jié)果顯示，盜蜜對植物的結(jié)實可能不會產(chǎn)生影響，但也有可能會通過影響傳粉者行為而影響傳粉者介導的結(jié)實[9]?？傊I蜜如何通過影響植物與傳粉者的互利共生關(guān)系，最終影響植物的適合度與進化仍不明了。通過人工操縱法隔離盜蜜者作為對照，可針對性評價盜蜜的生態(tài)學后果，有利于更深入地研究多物種間的相互作用和協(xié)同進化。用紗網(wǎng)袋套住植物的花冠或蜜距隔離盜蜜者時，紗網(wǎng)袋顏色可能會干擾傳粉者正常訪問，因為傳粉者往往偏愛某種顏色的花[2,3]。因而，篩選出一種對傳粉者干擾最小的紗網(wǎng)袋顏色成為最急需解決的問題。研究盜蜜對傳粉者訪花行為的影響，若在傳粉者訪問的高峰時間段進行觀測，效果更明顯，因而傳粉者一天中的訪花節(jié)律也值得進一步探討。研究發(fā)現(xiàn)，傳粉者一天中的訪問節(jié)律與環(huán)境因子以及植物的花部特征、花蜜產(chǎn)量等密切相關(guān)[10-12]，每個時間段的花蜜體積、糖濃度變化尤為明顯[13]，這意味著傳粉者在不同時間的訪花頻率存在一定差異。那么，找到一天之中傳粉者訪花頻率最高的時段，也可為有效的人工授粉時間提供依據(jù)。若能有效地提高植物的授粉概率，可為促進植物的生殖成功提供參考。

鳳仙花屬（ImpatiensL.）是被子植物中的一個大屬，隸屬于鳳仙花科（Balsaminaceae），全世界共有900多種，中國作為世界鳳仙花屬的分布中心之一，擁有該屬240多個物種[14]。鳳仙花屬家族龐大，花朵嬌嫩多汁，花部結(jié)構(gòu)復雜，且具有非常廣泛的多樣性和各個類型的傳粉者，是比較理想的研究植物分類學的材料，也是眾多傳粉生物學家關(guān)注的熱點類群[15-17]。擁有長花冠筒或是蜜距的植物容易被盜蜜，在該屬植物中，長蜜距花被盜蜜的現(xiàn)象十分普遍[15,18,19]。研究盜蜜通過影響傳粉者行為而介導該屬植物的生殖成功對于理解多物種的相互作用機制及其后果具有重要的意義。

因此，選擇了4種顏色（黑、白、紅、綠）紗網(wǎng)袋套蜜距，以不套蜜距作為對照，在一天中6個時間段，分別觀測紅雉鳳仙花傳粉者的訪花頻率和單花停留時間，以篩選出對傳粉者訪花行為影響最小的紗網(wǎng)袋顏色和最佳的訪問時間段，便于后續(xù)開展盜蜜的生態(tài)學研究。

1 材料與方法

1.1 研究地自然概況

實驗地位于四川省峨眉山萬年寺附近，該區(qū)屬于亞熱帶濕潤季風氣候，主要植被類型是以常綠闊葉為主的亞熱帶植被，平均氣溫17.2 ℃，雨量充沛，年均降雨量約1 764 mm[20]。峨眉山因資源植物種類豐富而位居于我國三大資源植物區(qū)域之首，尤其是在藥用、觀賞和食用等方面的資源植物最為豐富多樣[21]。峨眉山擁有的植物約占中國植物物種總數(shù)的1/10，其中特有鳳仙花有12種[22]，是我國鳳仙花屬植物的集中分布區(qū)之一。

1.2 研究材料

研究材料是我國特有植物紅雉鳳仙花（Impatiens oxyantheraHook.f），隸屬于鳳仙花科（Balsaminaceae）鳳仙花屬（ImpatiensL.）。紅雉鳳仙花高20～40 cm，全株無毛?？偦üＩ谏喜咳~腋，長于葉柄短于葉；苞片卵形，頂端突尖；花大，紅色或淡紫紅色[14]?；ü谕查L約為20.4 mm，蜜距長約29.5 mm[10]。其主要的傳粉者為三條熊蜂（Bombus trifasciatusSmith），主要的盜蜜者為短頭熊蜂（Bombus brevicepsSmith），前期觀察該植物發(fā)現(xiàn)盜蜜程度可達90.58%[15]。

1.3 實驗設(shè)計

實驗在峨眉山市黃灣鄉(xiāng)黑水村租用的農(nóng)用地（29°36′N，103°21′E，海拔 908 m）中進行。2017年3月底，將野生紅雉鳳仙花幼苗移栽至花盆。花盆底部先鋪放一層瓦片以便排水透氣，再裝入農(nóng)用地土壤，每個花盆中施有機肥100 g。每個花盆栽種1株幼苗，共216株，將所有花盆放置在6個2 m ×2 m小區(qū)中，每個小區(qū)內(nèi)按6行6列放置。紅雉鳳仙花喜陰濕環(huán)境，在試驗地上方覆蓋一層黑色塑料遮陽網(wǎng)（型號XN-95，遮陽網(wǎng)下相對光強 24 %，都江堰市新農(nóng)遮陽網(wǎng)廠）。實驗期間常澆水除草，夏季炎熱時，早晚澆水1次，以保證植株正常生長。

紅雉鳳仙花的花期在8—9月，雌雄異熟。于2017年8月下旬開始實驗，實驗采用單因素變量法。實驗處理前一天使用白色尼龍網(wǎng)袋（40目，15 cm × 10 cm）對未開放的花蕾進行套袋，以防止盜蜜，減少實驗干擾。第二天，選取已開放的花分組，每組5朵，每組用4種不同顏色（黑色、白色、紅色、綠色）的紗網(wǎng)袋（9 cm × 7 cm）套蜜距，余下1朵自然狀態(tài)不做處理作為對照（見圖1）。紅色紗網(wǎng)袋與紅雉鳳仙花的花冠顏色相近，綠色紗網(wǎng)袋則與植物葉片顏色相似，另外選擇對比強烈的黑色和白色紗網(wǎng)袋進行對比。每天4人共觀察8組（每人2組），重復觀察3 d，共24個重復組。

1.4 指標觀測

傳粉者的訪問頻率的觀測。于2017年8月21日—8月23日每天上午9:00—9:30、10:00—10:30、11:00—11:30和下午 14:30—15:00、15:30—16:00、16:30—17:00共6個時間段，4人分別記錄5種實驗處理的目標花朵被傳粉者訪問的次數(shù)。每種處理的8朵花共觀察72 h。

圖 1 用不同顏色紗網(wǎng)袋對紅雉鳳仙花蜜距進行套袋Fig. 1 Bagging the nectar spur of Impatiens oxyanthera with different colored gauze bags

傳粉者訪花單花停留時間的觀測。于2017年8月21日—8月23日每天9:30—9:50、10:30—10:50、11:30—11:50、15:00—15:20、16:00—16:20、17:00—17:20共6個時間段，4人分別用秒表記錄實驗處理的5朵花在上述6個時間段，不同套袋處理花朵被傳粉者訪問時的單花停留時間。每種處理的8朵花共觀察48 h。

1.5 數(shù)據(jù)計算與分析

用Excel、SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性分別用非參數(shù)檢驗中的單樣Kolmogorov-Smirnov檢驗和Levene法檢驗。因數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，故采用非參數(shù)檢驗的多個獨立樣本的Kruskal-Wallis H(K)檢驗分析5種處理之間平均值差異的顯著性，檢驗蜜距所套不同紗網(wǎng)袋的顏色以及時間段兩個因素對傳粉者訪問頻率和單花停留時間的影響。在R語言（版本3.6.3）中，用rcompanion包scheirerRayHare()函數(shù)分析紗網(wǎng)袋顏色、觀測時間段以及兩者的交互作用對傳粉者訪問頻率和單花停留時間影響的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳粉者的訪問頻率

研究發(fā)現(xiàn)，紗網(wǎng)袋顏色和觀測時間段兩者的交互作用對傳粉者訪花頻率影響不顯著（H= 20.395，P> 0.05）（見圖2）。不同顏色紗網(wǎng)袋對傳粉者訪花頻率差異顯著（χ2= 15.977，P< 0.05）（見圖3），尤其在上午9:00—9:30時間段內(nèi)，黑色紗網(wǎng)袋標記的花朵被訪問頻率顯著低于其他處理（χ2= 10.765，P< 0.05）。對照花朵單花被訪問頻率最高（0.611 ±0.027次·30 min?1），白色紗網(wǎng)袋標記的花朵被訪問次數(shù)次之（0.576 ± 0.036 次·30 min?1），黑色紗網(wǎng)袋標記的花朵被訪問的頻率最少（0.285 ± 0.021次·30 min?1），對照花朵比黑色紗網(wǎng)袋標記的花朵平均訪問頻率高 0.326 ± 0.006 次·30 min?1（見圖 3），白色紗網(wǎng)袋標記花朵的訪問頻率與對照組花朵最接近。

其中，觀測時間段對目標花朵被傳粉者訪問的頻率影響顯著（χ2= 30.814，P< 0.001）（見圖 4），在觀測的6個時間段中，下午14:30—15:00單花訪問頻率最高（0.725 ± 0.028 次·30 min?1），分別顯著高于上午11:00—11:30、下午15:30—16:00以及16:30—17:00的相應值。在上午和下午前半段的訪花頻率均高于后半段，特別是下午，即上下午均出現(xiàn)了一個訪花的高峰期。9:00—9:30、10:00—10:00、14:30—15:00這3個訪花頻率較高時間段的訪花頻率約為其他3個時間段的1.75倍。

2.2 傳粉者的單花停留時間

圖 2 不同顏色和時間段的紗網(wǎng)袋對傳粉者訪問頻率的影響Fig. 2 Effects of different gauze bag colors and observation time periods on the visiting frequency of pollinators

圖 3 不同顏色的紗網(wǎng)袋對傳粉者訪問頻率的影響Fig. 3 Effects of different gauze bag colors on the visiting frequency of pollinators

紗網(wǎng)袋顏色和觀測時間段兩者的交互作用對傳粉者單花停留時間影響不顯著（H= 22.307，P> 0.05）（見圖5）。非參數(shù)檢驗表明，不同顏色紗網(wǎng)袋標記花朵被傳粉者訪問停留的平均時間差異不顯著（χ2=2.306，P> 0.05）（見圖6），特別是在上午10:30—10:50期間，不同顏色紗網(wǎng)袋處理與對照組之間的傳粉者單花停留時間沒有幾乎差異。白色紗網(wǎng)袋標記花朵平均停留時間最長5.764 ± 0.238 s，黑色紗網(wǎng)袋標記花朵被傳粉者訪問平均停留時間最短5.023 ±0.251 s，對照花朵平均停留時間5.133 ± 0.130 s。

不同時間段之間，傳粉者訪問花朵停留時間差異不顯著（χ2= 4.408，P> 0.05）（見圖 7）。上午9:30—9:50，訪花單花停留時間最長6.327 ± 0.118 s，其他5個時間段內(nèi)單花停留時間相差無幾，平均停留5.299 ± 0.028 s。同時，在訪問頻率較高的時間段，5種紗網(wǎng)袋之間單花停留時間差異越小，而在訪問頻率較低的時間段，5種紗網(wǎng)袋之間單花停留時間差異越大。

圖 4 時間段對傳粉者訪問頻率的影響Fig. 4 Effects of observation time periods on the visiting frequency of pollinators

3 討論

3.1 紗網(wǎng)袋顏色對傳粉者訪花行為的影響

圖 5 不同顏色紗網(wǎng)袋、時間段對傳粉者單花停留時間的影響Fig. 5 Effects of different gauze bag colors and observation time periods on the visiting duration time of pollinators

圖 6 不同顏色紗網(wǎng)袋對傳粉者單花停留時間的影響Fig. 6 Effects of different gauze bag colors on the visiting duration time of pollinators

圖 7 時間段對傳粉者單花停留時間的影響Fig. 7 Effects of observation time periods on the visiting duration time of pollinators

花部綜合特征包括花色、形態(tài)、大小和氣味等[23]，而昆蟲訪花偏好受花部綜合特征影響[24]，有研究表明傳粉昆蟲對花色具有識別能力[25,26]，花色是吸引傳粉者訪問的重要因素之一，某一花色對傳粉者具有吸引力[2,3]，例如：熊蜂往往更喜歡訪問顏色艷麗的花朵，如粉紅色、黃色和藍紫色[27,28]。本研究表明，紗網(wǎng)袋顏色對目標花朵被傳粉者訪問的頻率影響顯著，對照花朵被訪問頻率最多，其次是白色，最少的是黑色紗網(wǎng)袋套蜜距的花朵。由此可見，不同顏色的紗網(wǎng)袋確實會干擾傳粉者訪花的行為，且白色相對影響最小，黑色影響最大。紅雉鳳仙花花色為淡紫紅色，熊蜂喜歡粉紅色花冠，有研究發(fā)現(xiàn)白色花冠反射光譜的波峰與粉色的花冠有重合[27]，不會對花色產(chǎn)生太大干擾，因此套白色紗網(wǎng)袋的花相比其他紗網(wǎng)袋顏色更容易被熊蜂識別，所以訪花頻率更接近對照。黑色花顏色不艷麗、不易吸引昆蟲，加上黑色吸收全部光波，陽光下升溫快致使花組織受到傷害[29]，因此自然界黑色花很少。先前也有研究發(fā)現(xiàn)黑色令蜂類產(chǎn)生明顯的趨避作用[30]，與本研究結(jié)果相似。另一研究結(jié)果為紗網(wǎng)袋顏色對傳粉者單花停留時間無顯著影響。說明一旦傳粉者訪問花朵后，在花上停留的時間可能不受紗網(wǎng)袋顏色的影響，而受花朵的花部特征如花冠大小、花蜜體積和含糖量等的影響[11-13]。本實驗的花為隨機選擇，并進行隨機處理，故受試花朵在花冠大小、花蜜特征無顯著差異，并且紗網(wǎng)袋套蜜距外，傳粉者訪花是在花冠內(nèi)活動，故傳粉者單花停留時間受其直接影響小。最終導致紗網(wǎng)袋顏色對傳粉者單花停留時間無顯著影響。

3.2 觀測時間段對傳粉者訪花行為的影響

傳粉者的活動會受到氣溫、光照和蜜源豐富度等的影響[13,31]。本研究表明，觀測時間段對目標花朵被傳粉者訪問的頻率和單花停留時間影響均顯著。下午14:30—15:00訪問次數(shù)最多，其次是上午9:00—9:30和10:00—10:30，而上午9:30—9:50單花停留時間最長。傳粉者一天中的訪問節(jié)律與光照強度、氣溫等環(huán)境因子以及植物的花部特征、花蜜產(chǎn)量等有關(guān)[10-12]，使得傳粉者在不同的時間段內(nèi)其訪問頻率和單花停留時間差異顯著。上午9:30—9:50，單花停留時間最長，有研究發(fā)現(xiàn)該時間段花蜜體積較多和果糖含量較高[13]，吸引傳粉昆蟲覓食。下午14:30—15:00訪問次數(shù)較多，該時間段也存在花蜜糖濃度升高的現(xiàn)象[13]，這與訪問次數(shù)多相對應。

綜上所述，用白色紗網(wǎng)袋套紅雉鳳仙花蜜距對傳粉者訪花行為干擾最小，觀測時間以上午9:30—9:50和下午14:30—15:00為宜。這為今后開展盜蜜對植物與傳粉互利共生關(guān)系影響以及對傳粉者干擾最小的隔離方法等研究提供了新的參考。