李 念 陽 霞 李 瓊 孝 俊

心肌損傷是多種心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的重要原因之一，心肌細胞過度凋亡是誘導(dǎo)心肌損傷的關(guān)鍵因素[1]。阿霉素是具有抑制DNA和RNA合成作用的抗腫瘤藥物，其副作用是能夠誘發(fā)藥物性心肌病，引起心力衰竭，是常見的體外研究心肌細胞損傷模型的誘導(dǎo)因子[2]。心肌損傷發(fā)生機制十分復(fù)雜，受到細胞內(nèi)多種基因的表達調(diào)控作用，這些基因之間構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響疾病的發(fā)生[3]。miRNA是一類在人體組織和細胞中普遍表達的非編碼RNA，其在不同病理以及生理過程中的作用可能不同[4]。很多研究表明，miRNA異常表達與心肌損傷有關(guān)，miRNA參與調(diào)控病理條件下心肌細胞凋亡的發(fā)生，可能是改善心肌損傷的分子靶點[5]。miR-199a-5p定位于人類19號染色體上，在人體組織中廣泛表達，具有多種生物學(xué)作用，參與腫瘤、哮喘等疾病的發(fā)生[6，7]。有研究顯示，miR-199a-5p在缺氧復(fù)氧心肌細胞中高表達，并且下調(diào)miR-199a-5p可以抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，miR-199a-5p在心肌損傷中可能發(fā)揮促進作用[8]。Wnt/β-catenin在缺氧復(fù)氧心肌細胞損傷中激活水平降低，而激活Wnt/β-catenin信號能夠改善心肌細胞損傷[9]。既往研究表明，miR-199a-5p可以通過作用于Wnt信號通路參與腫瘤進展[10]。目前對miR-199a-5p在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中的作用還不明確。本次實驗以心肌細胞H9C2作為研究對象，利用阿霉素構(gòu)建心肌細胞凋亡模型，探討下調(diào)miR-199a-5p對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響和機制，為心肌細胞損傷分子靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥劑和儀器

CRL-1446心肌細胞H9C2購自通派(上海)生物科技有限公司；D8740-25阿霉素購自北京索萊寶科技有限公司(實驗時，阿霉素直接溶解在細胞培養(yǎng)液中，最終濃度為1μM)；9661 C-Caspase-3抗體、18583 c-Myc抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；miR-199a-5p inhibitor、inhibitor control由山東維真生物科技有限公司合成；11668019 Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；KF658 β-catenin抗體購自南京建成生物工程研究所；16096040 RNA提取試劑盒、4366597逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；K1018 CCK-8檢測試劑盒購自美國APExBIO公司；C6流式細胞儀購自美國BD公司；680酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；Exciycler 96熒光定量PCR儀購自韓國Bioneer公司；NANO2000紫外分光光度計購自美國Thermo公司；IX53倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.2 細胞分組和處理

心肌細胞生長密度為80%以上時，利用0.25%胰蛋白酶37℃消化傳代，生長至對數(shù)期時，將心肌細胞分成5組，(1)Control組：空白對照細胞，常規(guī)培養(yǎng)；(2)DOX組：在實驗開始時以1μM的阿霉素細胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)；(3)DOX+Anti-miR-NC組：在心肌細胞中轉(zhuǎn)染inhibitor control，然后在實驗開始時以1μM的阿霉素細胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)；(4)DOX+Anti-miR-199a-5p組：在心肌細胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor，然后在實驗開始時以1μM的阿霉素細胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)；(5)DOX+Anti-miR-199a-5p+DKK1組：在心肌細胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor，然后在實驗開始時以1μM的阿霉素和20ng/ml的Wnt/β-catenin信號抑制劑DKK1細胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明進行。

1.3 Realtime PCR方法測定miR-199a-5p表達

Control組、DOX組、DOX+Anti-miR-NC組和DOX+Anti-miR-199a-5p組細胞(n均=9)培養(yǎng)24h以后，收集細胞，在細胞內(nèi)添加Trizol試劑提取各組細胞總RNA，以miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA，體系配制如下：5μl的Total RNA、4μl的5×miScript RT Buffer、1μl的miScript Reverse Transcription Mix，最后添加RNase-free Water使體積為20μl，反應(yīng)條件為：37℃ 60min、95℃ 5min，合成的cDNA保存于-20℃。引物設(shè)計和合成均由上海生工完成，PCR引物如下：miR-199a-5p, forward: 5’-CCC AGT GTT CAG ACT ACC TGT-3’, reverse: 5’-GTG CGT GTC GTG GAG-3’; U6, forward: 5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’ ，reverse: 5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGG T-3’。PCR反應(yīng)體系包括：5μl的miScript Primer Assay、2μl的cDNA、25μl的Quanti Tect SYBR Green PCR Master mix、5μl的引物，最后添加RNase-free Water至體積為50μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 15min，而后95℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，共40個循環(huán)。以2-△△Ct方法計算miR-199a-5p的相對表達水平，U6作為內(nèi)參。

1.4 CCK-8測定細胞增殖

各組心肌細胞分別添加到96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)(n均=9)，每個孔內(nèi)加入100μl的細胞懸浮液(含有104個細胞)。于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后取出細胞培養(yǎng)板，加入100μl CCK-8溶液，置于37℃中結(jié)合4h。在酶標(biāo)儀上檢測450nm的A值，經(jīng)過空白孔(只會細胞培養(yǎng)液，不加入細胞)調(diào)零以后，計算細胞存活率變化。細胞存活率=(實驗組A值÷對照組A值)×100%。

1.5 流式細胞術(shù)測定細胞凋亡

各組細胞培養(yǎng)24h以后，用PBS溶液將細胞洗滌2次，每組細胞分別收集5×105個，以400μl的Binding Buffer重懸細胞，加入5μl的Annexin V-FITC到細胞懸浮液內(nèi)，均勻混合，置于4℃條件、避光環(huán)境中結(jié)合15min。再加入10μl的PI染色液，放在4℃環(huán)境中結(jié)合10min。上流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

1.6 Western blot測定C-Caspase-3、β-catenin、c-Myc蛋白表達

各組細胞(n均=9)培養(yǎng)24h以后收集細胞，以提前預(yù)冷的PBS溶液洗滌3次，用移液器吸除殘留液體。在細胞內(nèi)添加RIPA試劑，置于冰上結(jié)合15min，用細胞刮子收集各組細胞，4℃，12 000離心10min，收集上清，常規(guī)BCA法檢測上清液蛋白濃度。在蛋白樣品中添加1/4體積的5×Loading Buffer，100℃結(jié)合5min后置于冰上備用。制備12%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳。在每個上樣孔內(nèi)依次添加30μg的蛋白樣品，以80V的恒壓條件電泳40min，當(dāng)染料到達分離膠以后，再將電壓調(diào)整到120V繼續(xù)電泳。在90V的電壓條件下進行轉(zhuǎn)膜50min。將PVDF膜經(jīng)5%牛血清白蛋白封閉后，再置于稀釋好的一抗(C-Caspase-3、β-catenin、c-Myc抗體按照1∶400、1∶800、1∶800稀釋)溶液內(nèi)，4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，再置于含有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋溶液中，37℃孵育1h。以BeyoEcL Plus顯色試劑盒進行顯色。以ImageJ軟件分析各個條帶的灰度值，以GAPDH為參照，各目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值為該蛋白相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細胞miR-199a-5p表達水平比較

各組細胞miR-199a-5p水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與Control組相比，DOX組心肌細胞中miR-199a-5p表達水平升高(t=19.98，P<0.01)；與DOX+Anti-miR-NC組相比，DOX+Anti-miR-199a-5p組心肌細胞中miR-199a-5p表達水平降低(t=20.11，P<0.01)，見表1。

表1 各組心肌細胞中miR-199a-5p水平

2.2 各組心肌細胞凋亡水平比較

各組細胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3、β-catenin、c-Myc蛋白水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與Control組相比，DOX組心肌細胞存活率降低(t=9.08，P<0.01)，細胞凋亡率(t=27.95，P<0.01)和C-Caspase-3蛋白水平升高(t=27.95、18.98，P<0.01)，β-catenin、c-Myc蛋白水平降低(t=13.99、13.40，P<0.01)；與DOX+Anti-miR-NC相比，DOX+Anti-miR-199a-5p組心肌細胞存活率升高(t=7.39，P<0.01)，細胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平降低(t=14.24、13.38,P<0.01)，β-catenin、c-Myc蛋白水平升高(t=10.09、12.68，P<0.01)；與DOX+Anti-miR-199a-5p組相比，DOX+Anti-miR-199a-5p+DKK1組心肌細胞存活率降低(t=9.19,P<0.01)，細胞凋亡率升高(t=13.52,P<0.01)，細胞中C-Caspase-3蛋白表達水平升高(t=8.84,P<0.01)，β-catenin、c-Myc蛋白表達水平降低(t=12.65、13.86,P<0.01)；見圖1、圖2和表2。

圖1 各組心肌細胞凋亡(流式細胞術(shù))

圖2 各組心肌細胞中C-Caspase-3、β-catenin、c-Myc蛋白表達(Western Blot)

3 討 論

細胞凋亡是一個復(fù)雜過程，是細胞內(nèi)很多基因共同作用的結(jié)果。Caspase是一個與細胞凋亡關(guān)系密切的蛋白家族，其含有多個蛋白成員，這些蛋白成員在正常情況下以無活性的酶原形式存在，只有在受到外界因素刺激后，才能被活化剪切成有活性的Caspase，這些Caspase成員共同構(gòu)成Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生[11-13]。Caspase-3是位于Caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游因子，其活化后形成C-Caspase-3，而C-Caspase-3可以不可逆的誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生[14,15]。C-Caspase-3也被認為是細胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志[16]。本文結(jié)果表明，miR-199a-5p在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞中表達上調(diào)，并且下調(diào)miR-199a-5p可以抑制阿霉素誘導(dǎo)的細胞凋亡，提高細胞增殖活性，說明下調(diào)miR-199a-5p在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞損傷中發(fā)揮保護作用，提示miR-199a-5p可能是一個心肌細胞損傷因子。下調(diào)miR-199a-5p可以降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞中C-Caspase-3蛋白表達水平，說明下調(diào)miR-199a-5p有抑制心肌細胞凋亡的作用，這與細胞凋亡檢測結(jié)果一致。

表2 各組阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞存活率、凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平

miRNA是在自然界中廣泛存在的小分子RNA，其沒有開放閱讀框，沒有編碼蛋白質(zhì)的功能，miRNA能夠通過影響下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮多種生物學(xué)作用，如細胞生長、細胞凋亡、氧化應(yīng)激等[17]。miRNA還與人類疾病發(fā)生有關(guān)，在腫瘤、神級系統(tǒng)疾病等進展過程中扮演關(guān)鍵角色，miRNA有可能成為某些疾病分子靶向治療的靶點[18，19]。miR-199a-5p可能是一個心肌損傷促進因子，靶向抑制miR-199a-5p可能是治療阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的途徑。

miRNA參與不同病理以及生理進展與其復(fù)雜的調(diào)控機制有關(guān)，其可以通過影響下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)作用[20]。本實驗表明，下調(diào)miR-199a-5p可以提高阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷細胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達水平。β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白，c-Myc是Wnt/β-catenin信號的下游基因[21]。Wnt/β-catenin信號與細胞生長、分化及凋亡等有關(guān)，其在人體組織中廣泛表達[22,23]。有研究顯示，Wnt/β-catenin參與心肌損傷，在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞中Wnt/β-catenin激活水平降低，并且激活Wnt/β-catenin可以改善心肌損傷[24，25]。本實驗顯示，Wnt/β-catenin抑制劑可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-199a-5p對阿霉素心肌細胞凋亡的影響，說明下調(diào)miR-199a-5p通過激活Wnt/β-catenin信號抑制心肌細胞凋亡。 miR-199a-5p是一個與細胞生長、運動等關(guān)系密切的miRNA調(diào)控因子，參與惡性腫瘤生長[26]。研究顯示，miR-199a-5p參與缺氧復(fù)氧心肌損傷，其在心肌損傷中發(fā)揮促進作用，下調(diào)其表達可以抑制心肌細胞損傷，減少細胞凋亡[27]。本實驗首次證明了miR-199a-5p在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中可能發(fā)揮促進作用，其作用機制與激活Wnt/β-catenin信號有關(guān)。與心肌細胞損傷有關(guān)的基因及信號通路較多，已有研究[8]表明miR-199a-5p參與缺氧復(fù)氧心肌細胞損傷與HIF-1α-GSK3β-mPTP有關(guān)，miR-199a-5p是否還可通過HIF-1α-GSK3β-mPTP調(diào)控阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞損傷還不明確。

綜上所述，下調(diào)miR-199a-5p能夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，作用機制與激活Wnt/β-catenin信號有關(guān)。目前尚未在體內(nèi)實驗中驗證miR-199a-5p的作用，也沒有觀察上調(diào)miR-199a-5p對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響，而且對miR-199a-5p的下游具體的靶向調(diào)控機制以及其是否通過調(diào)控其它基因或信號通路發(fā)揮作用還不明確，后續(xù)研究將會對上述內(nèi)容進行深入探討。