李 銳，李皎皎，張聰聰，周 茜，高榮琨

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) a. 基礎(chǔ)部；b. 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

紫蘇［Perilla frutescens（L.）Britt.］屬于唇形科，一年生草本植物［1-2］。幾個世紀(jì)以來，紫蘇一直在東亞國家特別是在中國和日本被廣泛應(yīng)用，如可以用來做藥材，可以榨油，也可以應(yīng)用于化妝品等方面［3-4］；有些地區(qū)還將它用于飲食，如紫蘇葉子用于亞洲美食中的壽司、配菜和湯［5-7］。近些年來，紫蘇因其特有的活性物質(zhì)及營養(yǎng)成分成為一種倍受世界關(guān)注的多用途植物，其經(jīng)濟(jì)價值很高，是可以直接開發(fā)的野生植物資源［8-9］。

紫蘇中備受關(guān)注的化學(xué)成分多種多樣。目前雖已有紫蘇中相關(guān)活性成分的測定研究報道，如馬立麗等［10］報道紫蘇總黃酮具有顯著的健康效益，可作為食品添加劑用于預(yù)防高脂血癥；陳建欣等［11］報道了不同部位紫蘇中黃酮含量不同；秦紅英等［12］報道了用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定紫蘇中的有機(jī)酸和黃酮的含量；張蕾蕾等［13］報道了用微波法測定紫蘇中總黃酮類物質(zhì)及其成分分析；李秀信等［14］報道了紫蘇莖中黃酮類化合物的提取及鑒定。而紫蘇種子中黃酮類化合物的系統(tǒng)研究尚未見報道。因此，本研究通過加熱、超聲波輔助萃取檢測提取溫度、提取時間和提取劑濃度對紫蘇種子中總黃酮提取的影響，目的是優(yōu)化紫蘇種子中黃酮的提取方法，探究不同地區(qū)紫蘇種子中總黃酮含量的差異，以及采用HPLC分離紫蘇種子中的兩種主要有效成分蘆丁和木犀草素，以期為今后開發(fā)利用紫蘇資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院王計平老師實(shí)驗(yàn)室在同一地點(diǎn)種植的來自于不同地區(qū)的紫蘇種子。于秋季籽粒飽滿時，將種子采集回實(shí)驗(yàn)室，放置自然風(fēng)干，然后收集保存?zhèn)溆茫?5-16］。本試驗(yàn)的紫蘇來自于貴州都勻、遼寧阜新、寧夏中寧和陜西藍(lán)田。

1.2 方法

采用許綱等［17］的方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.3 mg/mL，在紫外可見分光光度計上進(jìn)行全波長掃描，確定最大吸收波長（圖1）。之后，在最大吸收波長處測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。然后以吸光度（absorbance，A）為縱坐標(biāo)，濃度（concentration，C）為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），得線性回歸方程：y=8.206 3x；R2=0.978 0。

將試驗(yàn)所需的紫蘇種子自然風(fēng)干后，放入研缽中研碎，研磨至成膏狀物體即可（由于油脂過多無法過網(wǎng)）?；诩訜岷统暡ㄝo助提取原理，對紫蘇種子黃酮進(jìn)行提取，提取完1 h內(nèi)，利用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法在λ=504 nm處采用紫外可見分光光度計測定產(chǎn)物的吸光度值，并計算其濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 蘆丁的全波長掃描結(jié)果Fig. 1 Full wave scanning results of rutin

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（λ=504 nm）Fig. 2 Standard curve of rutin (λ=504 nm)

HPLC條件：色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5μm），甲醇-0.4%磷酸［V（甲醇）∶V（0.4%磷酸）=53∶47］作為流動相，紫外檢測器檢測波長為320 nm，常溫，流速為1.0 mL/min［4］。進(jìn)樣分析試驗(yàn)重復(fù)3次，得到蘆丁和木犀草素的標(biāo)準(zhǔn)圖譜（圖3），圖譜清晰明辨，說明可以用此方法來測定未知樣品。

然后以標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果得到蘆丁回歸方程為y=16 166x，R2=0.999 6（圖4），木犀草素的回歸方程為y=19 490x，R2=0.989 0（圖5），兩者在相應(yīng)范圍內(nèi)都呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系。

圖3 蘆丁、木犀草素標(biāo)準(zhǔn)樣品HPLC圖譜Fig. 3 HPLC chromatograms of rutin and luteolin

圖4 蘆丁峰面積與濃度的關(guān)系Fig. 4 Relationship between peak area and concentration of rutin

圖5 木犀草素峰面積與濃度的關(guān)系Fig. 5 Relationship between peak area and concentration of luteolin

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel和DPS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對紫蘇種子中黃酮含量進(jìn)行單因素方差分析（one-Way ANOVA）和Duncan多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。方差分析前對黃酮含量進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)符合條件，故不需要進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時間和溫度對黃酮得率的影響

時間和溫度對紫蘇種子中黃酮的得率起關(guān)鍵作用。在不同溫度下，隨著提取時間的增加，黃酮得率都呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，高溫下更加明顯。如圖6所示，在提取的前120 min，不同溫度下總黃酮的提取率隨時間急劇增加，差異極顯著（t=70℃，F(xiàn)=344.170 0，P=0.000 1；t=50℃，F(xiàn)=198.450 0，P=0.000 1）。且70℃下在120 min時提取液中黃酮含量提取率最高，可達(dá)（4.39±0.05）%。在120 min后時間效應(yīng)逐漸減弱，因此一個較長的提取時間一般是有益的。而且可以明顯看出，黃酮類化合物在提取30～120 min之間產(chǎn)生，因此從加熱30 min開始至120 min的時間最適合黃酮類化合物的提取。紫蘇種子中總黃酮含量低于紫蘇葉中的總黃酮含量。

不同溫度下隨著時間的延長黃酮得率的變化趨勢一致，但升高溫度黃酮類化合物的得率明顯提高。如圖6所示，其中120 min時黃酮提取率從50℃時的（3.21±0.08）%增加到70℃時的（4.39±0.05）%。然而由于乙醇的沸點(diǎn)較低，70℃可能是紫蘇種子總黃酮提取的最佳溫度。

圖6 提取時間對黃酮得率的影響Fig. 6 Effects of extraction time on the yield of flavonoids

2.2 提取劑濃度對黃酮得率的影響

本研究以乙醇溶液為萃取劑，在固定提取時間（120 min）、提取溫度（70℃）和料液比［質(zhì)量（g）和液體體積（mL）的比為1∶20］下進(jìn)行提取試驗(yàn)，探討不同濃度的乙醇溶液對黃酮類化合物提取率的影響（圖7）。結(jié)果表明，乙醇濃度對黃酮類化合物的提取有影響。乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%時總黃酮化合物提取率為（4.39±0.05）%，乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%時總黃酮化合物提取率為（5.52±0.09）%，差異顯著（P=0.001 6）。因此，總黃酮類化合物的提取用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇較好。

圖7 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig. 7 Effects of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.3 不同提取方法下紫蘇種子中黃酮得率的比較分析

圖8 不同提取方法對黃酮得率的影響Fig. 8 The effects of different extraction methods on the yield of flavonoids

經(jīng)不同的方法提取紫蘇種子中的總黃酮，發(fā)現(xiàn)有明顯的不同（圖8）。傳統(tǒng)的加熱法下總黃酮含量在120 min內(nèi)隨時間的延長而增加，120 min后卻逐漸降低。而超聲波輔助萃取時，總黃酮含量在90 min內(nèi)隨時間的延長而增加，90 min后卻逐漸降低，且超聲波輔助萃取的最高總黃酮量低于加熱法提取的最高總黃酮量。這表明超聲波輔助不利于紫蘇種子中黃酮的長時間提取，推測可能長時間的超聲波萃取破壞了黃酮物質(zhì)。這與Wong等［18］報道的用超聲波提取法從植物中提取黃酮類化合物是一種可行方法，但其有效性在很大程度上取決于萃取條件，如萃取劑濃度、萃取溫度、萃取時間、料液比等相一致。

2.4 不同地區(qū)紫蘇種子中總黃酮含量的比較分析

為了考察來自不同地區(qū)在同一地方種植的紫蘇種子中黃酮類化合物是否有差異，抽取4個地區(qū)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，不同地區(qū)之間紫蘇種子總黃酮含量差異極顯著（F=59.739 0，P=0.000 1）。如圖9所示，所有參試的種子總黃酮含量平均值由左到右分別為（2.63±0.11）%、（3.55±0.19）%、（4.55±0.02）%和（4.39±0.05）%，其含量變異范圍為2.63%～4.55%。所有參試材料中，寧夏中寧材料種子中總黃酮含量最高，為陜西藍(lán)田的1.73倍。顯然寧夏中寧和貴州都勻是生產(chǎn)類黃酮的科學(xué)本種，黃酮類化合物含量高且易得。說明在紫蘇種質(zhì)資源中可以篩選出總黃酮含量低的陜西藍(lán)田，總黃酮含量高的寧夏中寧和貴州都勻可作為特用種質(zhì)材料，從而有利于開展紫蘇總黃酮的優(yōu)質(zhì)育種工作。

圖9 不同地區(qū)紫蘇種子中黃酮的含量Fig. 9 The content of flavonoids in Perilla frutescens seeds from different regions

2.5 HPLC對紫蘇種子中黃酮種類的分析

將制備好的樣品溶液在HPLC條件下進(jìn)樣測定，每個樣品重復(fù)3次，得到樣品圖譜（圖10），取其平均值，采用外標(biāo)法計算蘆丁和木犀草素的含量。結(jié)果顯示，同一地方種植的來自不同地區(qū)的紫蘇種子中蘆丁、木犀草素的含量存在較大差異。4種紫蘇種子中都含有一定量的蘆丁，其含量在（0.82±0.31）%～（5.62±0.91）%，各紫蘇種子中蘆丁的含量從高到低為：寧夏中寧＞陜西藍(lán)田＞貴州都勻＞遼寧阜新（圖11）。不同地區(qū)紫蘇種子中木犀草素的差異顯著，貴州都勻和遼寧阜新紫蘇種子中含有木犀草素，含量分別為（0.59±0.02）%、（0.52±0.03）%，陜西藍(lán)田和寧夏中寧中沒有檢出木犀草素（表1）。

圖10 不同地區(qū)紫蘇種子樣品的HPLC圖譜Fig. 10 HPLC chromatograms of purified flavonoids in Perilla frutescens seeds from different regions

圖11 不同地區(qū)紫蘇種子中蘆丁的含量Fig. 11 Content of rutin in Perilla frutescens seeds from different regions

表1 不同地區(qū)紫蘇種子中木犀草素的含量Tab. 1 Content of luteolin in Perilla frutescens seeds from different regions

3 討論

黃酮類化合物是一類次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等中，數(shù)量種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有解熱、抗微生物、止嘔、抗腫瘤、抗凝、止血、抗炎、抗過敏等活性，并具有較強(qiáng)的抗氧化作用［19］，因此，富含黃酮的材料利用價值高。黃酮類化合物在乙醇溶液中的浸出率較高，且提取液較易濃縮和干燥，因此，乙醇是一種好的提取劑［19］。但相關(guān)紫蘇中黃酮的文獻(xiàn)報道不一，且尚未有對于紫蘇種子中黃酮的分離測定的詳細(xì)報道。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙醇溶液的濃度、提取溫度、提取時間不同，紫蘇種子中黃酮類的浸出率不同。加熱提取中采用80%的乙醇溶液，溫度為70℃，提取時間為120 min時紫蘇種子中黃酮類的浸出率最高；采用超聲波輔助法提取短期內(nèi)加速了黃酮類物質(zhì)的浸出，但不利于長期提取，建議如果是需要盡可能浸出所有的黃酮類物質(zhì)應(yīng)采用加熱提取法。

馬堯等［20］的研究表明，紫蘇不同部位總黃酮含量不同。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：紫蘇種子中的總黃酮含量小于紫蘇葉中的總黃酮含量；不同地區(qū)的紫蘇種子中黃酮類組成和含量不同，寧夏中寧的黃酮含量是陜西藍(lán)田的1.73倍，而且差異極顯著（P＜0.01）。張蕾蕾等［13］的研究表明，紫蘇中主要黃酮類物質(zhì)是蘆丁和木犀草素。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來自不同地區(qū)的紫蘇在同一地方種植所獲得的紫蘇種子中蘆丁和木犀草素的含量差異顯著。貴州都勻紫蘇種子中蘆丁含量為（1.46±0.24）%，木犀草素含量為（0.59±0.02）%，而寧夏中寧中蘆丁含量為（5.62±0.91）%，木犀草素含量極少，差異極顯著（P＜0.01）。這可能是由于不同地區(qū)的紫蘇中黃酮具有不同的積累和調(diào)控途徑。但關(guān)于紫蘇種子中黃酮的積累機(jī)制和品種的鑒定還有待進(jìn)一步的研究。

總之，紫蘇種子材料中總黃酮的組成和含量存在較大的差異，總黃酮含量變化值為2.63%～4.55%，可為紫蘇品種的改良提供優(yōu)質(zhì)材料。紫蘇種子中的黃酮類化合物采用加熱浸提法是一種可行、有效的提取方法，總黃酮的提取率較高?？傸S酮的最佳提取條件：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，溫度為70℃，料液比為1:20，浸提時間為120 min。本試驗(yàn)建立了HPLC分離測定紫蘇種子中的蘆丁和木犀草素成分的方法，該方法操作簡單、檢出限低、靈敏、準(zhǔn)確，為紫蘇中黃酮的質(zhì)量評價提供了科學(xué)依據(jù)。