徐偉麗，穆 韡，魯兆新，徐貴華

（1 哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系 哈爾濱150001 2 哈爾濱工業(yè)大學(xué)生物分子與化學(xué)工程系 哈爾濱150001 3 河南科技學(xué)院食品學(xué)院 河南新鄉(xiāng)453003）

花色苷（anthocyanins，ACNs）是類黃酮水溶性色素，廣泛存在于花卉、水果、蔬菜、谷物和草藥中[1]。自然界中的ACNs 主要是黃酮基（2-苯基-苯并吡嗪鹽）的多羥基和多甲氧基糖苷衍生物[2]。流行病學(xué)研究表明，ACNs 的攝入可以改善許多慢性疾病，如心血管疾病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎和癌癥[3]。富含ACNs 的植物提取物，如漿果果渣提取物比單一酚類化合物具有更強(qiáng)的抗氧化作用[4]，但它們是不穩(wěn)定的化合物，在高pH 值、氧氣、光、熱和特定酶的存在下容易降解[5]，很難到達(dá)腸道，口服后生物利用度低。保護(hù)ACNs 的生物活性以增強(qiáng)其穩(wěn)定性并促進(jìn)其在目標(biāo)吸收位點(diǎn)的釋放，是一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn)。

研究證明W1/O/W2型復(fù)乳可以有效防止食品體系中各種成分的相互作用，是實(shí)現(xiàn)親水性生物活性物質(zhì)保護(hù)和靶向輸送的最佳微囊化技術(shù)[6-8]。最近，體外模型作為了解微膠囊的基本物理化學(xué)性質(zhì)和被包埋組分控釋的工具而備受關(guān)注[9]。消化時(shí)，內(nèi)水相、油相和外水相的物理性質(zhì)都對(duì)微膠囊的包埋率，生物活性成分的穩(wěn)定性及其控釋性質(zhì)起重要作用[10]。雖然此前報(bào)道了一些關(guān)于單層或雙層微膠囊的消化研究[11]，但是就復(fù)乳在胃、腸道消化時(shí)微觀結(jié)構(gòu)的變化及其內(nèi)水相或內(nèi)部W1/O單一乳液的靶向輸送情況尚未闡明。

此前關(guān)于包埋ACNs 的研究主要使用多糖作為外水相[12]，而對(duì)于使用WPI 溶液作為乳化劑包埋ACNs，以及通過(guò)口腔和胃、腸道連續(xù)消化負(fù)載ACNs 的W/O/W 型復(fù)乳的信息有限。本研究的目的是評(píng)價(jià)以葡萄皮粉ACNs 提取液為內(nèi)水相（W1），含聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR）的玉米油為油相，WPI 溶液為外水相（W2）的W/O/W 型復(fù)乳，表征其在體外消化過(guò)程中的微觀結(jié)構(gòu)、流變學(xué)特性、靶向傳輸和抗氧化活性的變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄皮粉，加拿大約瑟夫天然產(chǎn)物公司；WPI（97.5%蛋白質(zhì)），美國(guó)戴維斯科食品國(guó)際公司；玉米油，市購(gòu)；ACN 標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Indofine 化學(xué)公司；HCl、檸檬酸和苯甲酸鈉，美國(guó)Sigma 公司；聚甘油聚蓖麻油酸酯（PGPR，4175），美國(guó)Palsgaard 公司；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-羧酸（Trolox）、2，2'-偶氮二-（2-甲基丙脒）二鹽酸鹽（AAPH）、2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、L-抗壞血酸、熒光素和苯甲基磺酰氟（PMSF），Sigma-Aldrich 化學(xué)公司；氯化鈉和HPLC 級(jí)溶劑，加拿大卡利登實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

勻漿器（PT 2500 E），瑞士Kinematica AG 公司；微流化器，加拿大ATS 公司；光學(xué)顯微鏡、照相機(jī)（AxioCam MRC5），德國(guó)Zeiss 公司；粒度電位儀（Zetasizer），英國(guó)Malvern 儀器公司；流變儀（ARES-LS1），美國(guó)TA 儀器公司；UV 微板讀數(shù)器，美國(guó)Bio-Tek 儀器公司；離心過(guò)濾裝置（30，000-MWCO Amicon-Ultra 15），德國(guó)Millipore 公司；光電二極管陣列檢測(cè)器，德國(guó)安捷倫科技公司；C18分析柱（150 mm×4.6 mm i.d.×5 μL），中國(guó)北京迪科馬科技公司。

1.3 方法

1.3.1 制備WPI 溶液和葡萄皮提取物 將WPI粉末溶于去離子水（2.5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）中，磁力攪拌2 h，4 ℃過(guò)夜和儲(chǔ)存。將20 g 葡萄皮粉在600 mL 50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇中50 ℃超聲提取1 h，用濾紙（Whatman Grade No.1）過(guò)濾。如此進(jìn)行兩次，合并濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃條件下對(duì)其濃縮。將最終提取物（不含甲醇）置-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 復(fù)乳的制備 參考文獻(xiàn)[13]制備W1/O/W2型復(fù)乳。

1.3.3 模擬體外消化 根據(jù)先前報(bào)道[11]的方法進(jìn)行體外模擬消化。將沒(méi)有添加樣品的空白作對(duì)照，在相同條件下處理以校正來(lái)自消化酶和緩沖液的干擾。該體外消化模擬系統(tǒng)用于模擬人類口腔、胃和小腸的消化過(guò)程。

1.3.4 顯微鏡觀察 拍攝照片，評(píng)估乳液表面形態(tài)的變化。將光學(xué)顯微鏡與AxioCam MRC5 照相機(jī)連接，觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)（100×）。

1.3.5 粒徑和ζ-電勢(shì)測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 流變學(xué)性質(zhì)測(cè)定 用ARES-LS1 流變儀測(cè)定乳液的流變學(xué)性質(zhì)。測(cè)量期間乳液的溫度保持在25 ℃。

1.3.7 HPLC 法測(cè)定ACNs 將60 μL 葡萄皮提取物（相當(dāng)于1 mL W/O/W 乳液中的量）稀釋至5 mL（3.3 mL 5 mol/L HCl 和1.7 mL Milli-Q 水）。此溶液在100 ℃溫度下保持60 min，以確保將ACNs 完全水解成花青素。冷卻后，用0.45 μm 過(guò)濾器過(guò)濾。25 ℃條件下使用配備光電二極管陣列檢測(cè)器（PAD）和C18分析柱的Agilent 1100 系統(tǒng)進(jìn)行HPLC 分析。使用體積分?jǐn)?shù)10%甲酸（溶液A）和100%甲醇（溶液B）梯度洗脫，即：0～20 min，95%A/ 5%B 至40%A/60%B 的線性梯度洗脫；20～23 min，40%A/60%B 的等度洗脫；23～24 min，40%A/ 60%B 到95%A / 5%B 的線性梯度洗脫；24～28 min，95%A/5%B 的等度洗脫。洗脫液流速0.8 mL/min，注射樣品體積100 μL。在波長(zhǎng)520 nm 處定量外標(biāo)（即氯化翠雀寧、氯化矢車菊素、氯化天竺葵素和氯化錦葵色素），并基于峰面積建立校準(zhǔn)曲線。

1.3.8 W1/O/W2型復(fù)乳中ACNs 的釋放檢測(cè) 采用文獻(xiàn)[13]中的HPLC 法測(cè)定W/O/W 復(fù)乳中ACNs 的釋放率。計(jì)算ACNs 的包埋率（EE，%）公式：

式中，G1——乳液中游離ACNs 的含量（μg/mL）；G0——制備時(shí)加入的ACNs 總量（μg/mL）。

ACNs 的釋放率（R）計(jì)算公式：

1.3.9 W1/O/W2型復(fù)乳抗氧化活性評(píng)價(jià) 按照Li等[14]的方法測(cè)定樣品的抗自由基活性（DPPH 測(cè)定法）。提取物的氧自由基吸收能力（ORAC）測(cè)定采用文獻(xiàn)[11]的方法，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線將結(jié)果表示為μmol/Trolox 物質(zhì)的量。根據(jù)文獻(xiàn)[10]方法測(cè)定鐵還原能力（FRAP），抗氧化活性表示為μmol/L 抗壞血酸物質(zhì)的量。

1.3.10 乳液穩(wěn)定性測(cè)量 將不同消化階段收集的乳液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，用塑料蓋密封，25℃下儲(chǔ)存24 h。數(shù)碼相機(jī)拍攝乳液照片。

1.3.11 統(tǒng)計(jì)分析 文中使用SPSS 14.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為3 次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果的平均值（±s）。采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 W1/O/W2 型復(fù)乳的形態(tài)和儲(chǔ)存穩(wěn)定性

本研究使用PGPR 和WPI 作為乳化劑，制備包埋ACNs 提取物的W/O/W 型復(fù)乳（6%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)），乳液的形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)如圖1～4所示。結(jié)果表明，制備的所有乳液都質(zhì)地均勻且表面光滑（圖1A），W1/O/W2和O/W2乳液為白色并具有良好的流動(dòng)性，W1/O 乳液呈淺粉色，有黏性。W1/O/W2和O/W2乳液的平均粒徑分別為（287.90±3.12）nm（PDI=0.193±0.022）和（299.70±5.83）nm（PDI=0.146±0.023）。顯微鏡分析顯示，小油滴均勻分布在O/W2乳液的水相中（圖2B），水滴均勻分布在W1/O 乳液的油相中（圖2C）。此外，根據(jù)Florence等[15]分類，許多W1/O 小液滴存在于外水相內(nèi)部（圖2A），表明其為B 型W1/O/W2復(fù)乳。

圖1 乳液照片F(xiàn)ig.1 Photographs of different emulsions

乳液的穩(wěn)定性在食品加工和儲(chǔ)存過(guò)程中非常重要。4 ℃儲(chǔ)存5 周的樣品依舊均勻，無(wú)游離油滴，液滴未發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象（圖1A）。結(jié)果表明，4 ℃儲(chǔ)存35 d 的復(fù)乳表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。然而，W1/O/W2型復(fù)乳在胃中消化30 min 發(fā)生相分離現(xiàn)象，表明胃消化會(huì)破壞乳液的穩(wěn)定性（圖1B）。

2.2 體外模擬消化對(duì)W1/O/W2 型復(fù)乳微觀結(jié)構(gòu)的影響

使用顯微鏡（圖2）和激光衍射（圖3 和圖4）評(píng)估體外不同消化階段的W1/O/W2型復(fù)乳的微觀結(jié)構(gòu)。初始復(fù)乳乳滴的平均粒徑為（287.90±3.12 nm）（PDI=0.193±0.022）（圖3），整體粒徑分布在50～1 000 nm 范圍（圖4）。經(jīng)口腔消化后，液滴粒徑和形態(tài)未發(fā)生明顯改變 【d =（296.13 ± 2.52）nm】（圖3，圖2A，2D）。當(dāng)乳液經(jīng)口腔移動(dòng)到胃部消化后，液滴仍保留雙層結(jié)構(gòu)，但粒徑顯著增加【d=（619.40±15.96）nm】（圖2E，圖3 和圖4）。其原因是蛋白質(zhì)水解導(dǎo)致復(fù)乳的表面結(jié)構(gòu)改變，小液滴融合成具有雙層結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定的較大液滴。這也可能是圖1B所示相分離的原因。相反，Shima等[16]研究顯示雙層復(fù)乳在模擬胃部消化期間是穩(wěn)定的。而Xiao 等[17]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)復(fù)乳液滴在胃消化過(guò)程中塌陷并釋放出內(nèi)水相。上述研究結(jié)果的不一致可能與模擬胃液化學(xué)組分和pH 值不同以及外水相有關(guān)。

顯微照片證實(shí)，模擬腸道消化后乳滴完全失去雙層結(jié)構(gòu)并變?yōu)榭沼偷危▓D2F）。這表明雙層結(jié)構(gòu)的外部蛋白被完全消化，酶解使W1/O 液滴破裂并釋放ACNs，油相被膽汁鹽乳化后聚集并重新形成油滴，因此未觀察到相分離現(xiàn)象（圖1B）。Andrade 等[18]和Frank 等[19]的研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，也證實(shí)在體外消化過(guò)程中使用含脂肪酶和膽汁的人工消化液，W/O/W 型復(fù)乳發(fā)生油相的水解和聚結(jié)。

2.3 體外模擬消化對(duì)乳液ζ-電位的影響

監(jiān)測(cè)體外不同消化階段乳液液滴所帶電荷情況，即ζ-電位。WPI 穩(wěn)定的初始乳液（pH 6.6～6.8）具有負(fù)ζ-電位（約-45 mV）（圖5），這主要取決于乳化劑WPI 的性質(zhì)。模擬口腔消化（pH 6.8～7.0）后，乳液液滴帶有相對(duì)較少的負(fù)電荷（約-39 mV）。當(dāng)乳液經(jīng)口轉(zhuǎn)移到胃消化后，乳液電勢(shì)為正【（12.80±0.28）mV】（pH=2.0）。乳液液滴電荷的變化與多種因素有關(guān)，例如：溶液pH 值和離子強(qiáng)度的變化，或者帶電物質(zhì)從胃液吸附到乳化劑涂層上。模擬胃液消化后，如果界面組成沒(méi)有變化，pH 值低于等電點(diǎn)（PI），WPI 包被的微粒就會(huì)攜帶正電荷[20]。WPI 含有球狀蛋白質(zhì)，如β-乳球蛋白，可以形成共價(jià)交聯(lián)的界面。在模擬胃消化過(guò)程中，β-乳球蛋白對(duì)酸和酶的降解具有抗性[21]。這可以解釋大量乳滴在模擬胃環(huán)境中保留蛋白層的現(xiàn)象。乳液經(jīng)胃轉(zhuǎn)移到模擬小腸（pH 6.8）消化后的ζ-電位值（-63.97±3.04）mV 甚至高于初始乳液。pH 值的影響是乳液微粒攜帶較多負(fù)電荷的主要原因。其它研究[22]也報(bào)道了在體外消化模型中β-乳球蛋白包被的液滴ζ-電位的類似結(jié)果。

圖2 不同乳液的顯微照片F(xiàn)ig.2 Photomicrographs of different emulsions

圖3 不同體外消化階段W1/O/W2 型復(fù)乳液滴的平均粒徑Fig.3 Mean particle diameters of W1/O/W2 emulsion after in vitro digestion

圖4 W1/O/W2 型復(fù)乳的粒徑分布Fig.4 Particle size distributions of W1/O/W2 emulsions

圖5 W1/O/W2 乳液的ζ-電位Fig.5 ζ-potential of W1/O/W2 emulsions

2.4 體外模擬消化對(duì)乳液流變學(xué)性質(zhì)的影響

流變特性與食品配方、加工條件以及食品口感等感官特性高度相關(guān)[23]，這使其在食品應(yīng)用方面非常重要。在給定質(zhì)量濃度的乳液中，乳液黏度取決于液滴相互作用的性質(zhì)和聚集程度[24]。本研究使用流變儀追蹤體外不同消化階段乳液的黏度變化（圖6）。隨著剪切速率的增加，W1/O/W2復(fù)乳和O/W2乳液的黏度未發(fā)生明顯變化，表明這些乳液屬于牛頓流體。這與Wang 等[25]的研究結(jié)果一致。然而，另有報(bào)道顯示，復(fù)乳是非牛頓流體，其復(fù)雜的流變行為，使在高剪切力下變稀的程度更大[26]。最近的一項(xiàng)研究表明當(dāng)剪切速率在1～100 s-1時(shí)，O/W 乳液表現(xiàn)出典型的假塑性流體特性[27]。這些不同的結(jié)果可能是由所用乳化劑的類型和濃度，以及分散相的體積不同所致。隨著剪切速率的增加，W/O 乳液的黏度緩慢下降，表明這些乳液是非牛頓流體[28]。Jiao 等[29]也得出相同的結(jié)論。然而，Abivin 等[30]發(fā)現(xiàn)W/O 乳液的黏度與剪切速率曲線表現(xiàn)出牛頓流體特性。W1/O/W2和O/W2乳液與水的黏度相近（＜0.1），W1/O 乳液的黏度高于這兩種乳液（W1/O/W2和O/W2）。體外消化后，W1/O/W2乳液發(fā)生剪切變稀，可能是由乳液液滴變形和/或結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致的[31]。

2.5 體外模擬消化對(duì)W1/O/W2 乳液中ACNs 釋放的影響

研究了體外消化對(duì)W1/O/W2乳液中包埋的ACNs 釋放的影響，結(jié)果如圖7所示。初始W1/O/W2復(fù)乳ACNs 的包埋率為（93.19±2.78）%。在口腔消化后，ACNs 仍保持在乳液的內(nèi)水相中。經(jīng)胃消化后，復(fù)乳的內(nèi)水相中ACNs 少量被釋放，這是因?yàn)槿橐何⒘Ｈ跃哂须p層結(jié)構(gòu)，ACNs 主要存在于微粒的內(nèi)部水相（圖2E）。Frank 等[19]、Oidtmann 等[32]和Flores 等[11]也有類似的發(fā)現(xiàn)。然而，Xiao 等[17]和Andrade 等[18]證明，在胃消化階段由于液滴結(jié)構(gòu)的破壞，W/O/W 復(fù)乳的內(nèi)水相（W1）大部分釋放。而Shima 等[16]的研究表明復(fù)乳不受人工無(wú)酶胃液的影響，包埋率沒(méi)有變化。

ACNs 主要在模擬腸道消化過(guò)程中釋放，釋放率為（41.89±2.95）%。其主要原因可能是胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化，復(fù)乳成為單一的W1/O 乳液，而W1/O 液滴的油層進(jìn)一步被酶水解，ACNs 被釋放。相反，Aditya 等[33]報(bào)道在體外無(wú)酶腸道消化1 h，超過(guò)45%的姜黃素從W/O/W 復(fù)乳中釋放出來(lái)。這種差異可能與人工消化液的化學(xué)成分、包埋方法、壁材類型或內(nèi)層水相的物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)[18]。

圖6 乳液的黏度-剪切速率曲線圖Fig.6 Viscosity-rate of shear curves for emulsions

2.6 體外模擬消化過(guò)程中W1/O/W2 復(fù)乳抗氧化活性的變化

圖7 ACNs 在W1/O/W2 復(fù)乳中的包埋率Fig.7 The encapsulation efficiency of ACNs in W1/O/W2 emulsions

包埋ACNs 的復(fù)乳在體外不同消化階段的抗氧化活性如圖8所示。在體外消化過(guò)程中乳液的FRAP 值沒(méi)有明顯的變化。然而，DPPH 和ORAC值隨著體外消化的進(jìn)行呈顯著增加趨勢(shì)（P＜0.05）。在模擬腸道消化后，從乳液檢測(cè)出最高的抗氧化活性，其原因主要是微膠囊中ACNs 的大量釋放。Ydjedd 等[34]研究表明：在腸道消化過(guò)程中最高劑量的酚類物質(zhì)和類黃酮物質(zhì)從微膠囊中釋放出來(lái)。這一結(jié)果與本研究發(fā)現(xiàn)一致。經(jīng)胃消化后，仍有（82.13±1.90）%的ACNs 包埋在油相中。然而，與初始復(fù)乳和經(jīng)口腔消化后的復(fù)乳（階段I）相比，經(jīng)胃消化后的復(fù)乳具有更高的抗氧化活性（P＜0.05）。這可歸因于胃消化過(guò)程中W1/O/W2液滴的雙層結(jié)構(gòu)被破壞且ACNs 在親水介質(zhì)中易于擴(kuò)散[33]。WPI 被消化酶水解產(chǎn)生的抗氧化肽，可能也是這種高抗氧化活性的部分原因[35]。本研究結(jié)果表明，在整個(gè)模擬胃、腸消化過(guò)程中W1/O/W2復(fù)乳能夠穩(wěn)定ACNs 的高抗氧化活性。然而，Cofrades等[36]報(bào)道了相反的結(jié)果，由于體外模擬胃部和腸道消化使生物活性化合物損失，因此使復(fù)乳和凝膠化復(fù)乳的抗氧化活性顯著降低。

圖8 W1/O/W2 乳液的抗氧化活性Fig.8 Antioxidant activity of W1/O/W2 emulsions

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，負(fù)載ACNs 的W1/O/W2復(fù)乳具有較高的包埋率【（93.19±2.78）%】和較好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。口腔消化后復(fù)乳的液滴未發(fā)生明顯的形態(tài)變化。經(jīng)模擬胃液消化后，大量液滴相互融合形成不穩(wěn)定的較大顆粒，然而仍具有雙層結(jié)構(gòu)。在腸道消化過(guò)程中，液滴釋放出內(nèi)部水相而變成油滴。黏度分析結(jié)果也表明，體外消化使復(fù)乳液滴的結(jié)構(gòu)受損。此外，ACNs 釋放率和抗氧化活性分析證實(shí)包埋的ACNs 可針對(duì)性地運(yùn)送至模擬小腸中。這些結(jié)果表明，W1/O/W2復(fù)乳是潛在的，可用于穩(wěn)定水溶性生物活性成分并控制其在腸道中靶向釋放的微載體系統(tǒng)。