湯 純，劉 芳，諸永志，吳海虹，孫芝蘭

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 南京210014）

克氏原螯蝦俗稱小龍蝦（Procambarus clarkii），原產(chǎn)于北美洲地區(qū)[1]，上世紀(jì)20年代由日本傳入我國，現(xiàn)廣泛分布于我國長江中、下游地區(qū)，已成為重要經(jīng)濟(jì)蝦類。本世紀(jì)初，小龍蝦產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，2017年全國小龍蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)112.97 萬t[2]，然而，相關(guān)食品衛(wèi)生問題頻頻發(fā)生。2010年，南京部分地區(qū)醫(yī)院急診科陸續(xù)接診了多個因食用小龍蝦患橫紋肌溶解癥的病人[3]；江西瑞昌、湖北十堰等地先后出現(xiàn)副溶血性弧菌（V.parahemolyticus）集體性食物中毒事件[4-5]。小龍蝦營養(yǎng)豐富且主要生活在水體環(huán)境中，因此，生鮮小龍蝦自身攜帶多種微生物，極不耐運(yùn)輸儲藏[6-8]。張生元等[9]和朱若林等[10]從安徽肥東某養(yǎng)殖場的瀕死蝦中分離到布氏檸檬酸桿菌。李兵兵等[11]在淮安地區(qū)發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)仵r活小龍蝦攜帶副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等致病菌。

傳統(tǒng)培養(yǎng)基分離鑒定法是利用各類具有選擇性的固體培養(yǎng)基對樣品處理液中的細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)、分離，而后提取、擴(kuò)增DNA，通過NCBI Blast分析DNA 序列，確定菌株類別[12]。此方法在實施過程中人為主觀意識較強(qiáng)，僅憑視覺挑選單菌落，容易遺漏腐敗菌。此外，傳統(tǒng)平板培養(yǎng)基不能毫無遺漏地培養(yǎng)出樣品攜帶的全部細(xì)菌，自然環(huán)境中可通過此方法培養(yǎng)得到的細(xì)菌僅占1%[13-14]。宏基因組測序法可以彌補(bǔ)這一不足，它能對數(shù)10 萬條DNA 同時測序，針對性地分析樣品所攜帶菌群的基因組[15]。鄧曉影等[16]和江艷華等[17]分別利用宏基因組測序法全面分析南美白對蝦、蝦夷扇貝柱的菌群多樣性。江楊陽等[18]采用上述2 種方法探尋小龍蝦低溫保藏時的腐敗菌，得出宏基因組測序法結(jié)果的菌群多樣性更高。

小龍蝦好溫喜濕，不同產(chǎn)地的地理條件、養(yǎng)殖環(huán)境與飼料不盡相同，因此在研究其所攜帶菌群時，需結(jié)合多個因素綜合考慮[19]。本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)以及宏基因組測序法，選擇浦口和太湖東山產(chǎn)區(qū)的小龍蝦，分析鮮活小龍蝦整體、表面及尾肉部位的菌群組成，歸納其攜帶的污染菌，為小龍蝦的保鮮、運(yùn)輸研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小龍蝦來源于浦口、太湖東山，冷鮮包裝后由順豐快遞寄至實驗室備用。

PCA 菌落計數(shù)培養(yǎng)基、BHI 腦心浸液肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）、甘露醇氯化鈉瓊脂（MSA）、乳酸菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MRS）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、營養(yǎng)肉湯（NB）、腦心浸出液肉湯（BHI），北京奧博星生物技術(shù)有限公司；假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CN 瓊脂），山東青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M124A 電子分析天平，意大利BEL 公司；SW-CJ-1FD 型無菌操作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Centrifuge 5810 R 離心機(jī)、Centrifuge 5424 R 離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；Unicen MR 臺式冷凍離心機(jī)，德國Hero lab 公司；Direct-Q3 純水/超純水一體化系統(tǒng)，默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 樣品處理

對兩產(chǎn)地小龍蝦分別進(jìn)行3 種處理：①稱取50 g 鮮活小龍蝦，均質(zhì)后隨機(jī)取10 g 加入90 mL生理鹽水得到小龍蝦整體樣品；②隨機(jī)挑選10 只大小均等的小龍蝦，加入225 mL 生理鹽水得到小龍蝦表面樣品；③無菌條件下取出蝦尾肉，取10 g剪碎后加入90 mL 生理鹽水得到小龍蝦尾肉（帶腸）樣品。每組樣品設(shè)置3 個平行，分別均質(zhì)30 min。

1.4 菌落計數(shù)與優(yōu)勢腐敗菌保種

采用GB 4789.2-2016[20]的方法測定小龍蝦樣品中的菌落總數(shù)。利用平板涂布法將1.3 節(jié)中的樣品稀釋液涂布于VRBGA、CN 瓊脂、MSA、PCA和MRS 固體平板，30 ℃培養(yǎng)24 h 后計數(shù)。選取5類培養(yǎng)基平板上不同形態(tài)的菌落，分離、純化后接種到5 mL 相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)。菌液混濁（此時OD600nm=1）時，按V菌液∶V50%無菌甘油=3∶2混合，放入-80 ℃冰箱保存。

1.5 樣品總DNA 提取

將1.3 節(jié)中的樣品均質(zhì)液在4 ℃，2 000 r/min條件下離心10 min，取上清。在4 ℃，12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，收集沉淀。質(zhì)檢DNA，將合格樣品置于-80 ℃保存。

1.6 MiSep 測序和數(shù)據(jù)分析

將在-80 ℃冰箱中凍存的DNA 樣品置于干冰中，送至奧維森有限公司測序，使用 Illumina Miseq PE300 高通量測序平臺。在細(xì)菌16S rDNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行菌群檢測，利用引物338F（5′-ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3′）及806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）對樣品進(jìn)行擴(kuò)增[21]。Paired-end 測序仍采用該平臺，完成后用QIIME（v 1.8.0）軟件處理數(shù)據(jù)，對雙端序列數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，調(diào)整序列方向，歸納有效序列[22]。利用barcodes 將各樣品的序列歸類為操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU），相似性為97%[23]。將每個OTU 比對Silva 數(shù)據(jù)庫，獲得相應(yīng)物種信息。Alpha 多樣性分析選用Mothur 軟件（version 1.31.2）[24]。匯總比較兩產(chǎn)地生鮮小龍蝦攜帶的微生物群落，統(tǒng)計微生物群落結(jié)構(gòu)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

方差分析使用SPSS 16.0 軟件，獲得顯著性分析。所有試驗重復(fù)3 次。

2 試驗結(jié)果

2.1 兩地區(qū)小龍蝦初始菌落數(shù)分析

圖1 為3 個產(chǎn)地小龍蝦初始菌落數(shù)。由圖1a可知，浦口小龍蝦整體樣品和太湖東山小龍蝦整體樣品的菌落總數(shù)相近，分別為7.78 lg（CFU/g）和7.76 lg（CFU/g）。浦口、太湖東山地區(qū)的小龍蝦表面所含菌落數(shù)為6.49，7.37 lg（CFU/g）（圖1b）。從圖1c 可知，浦口小龍蝦尾肉的菌落數(shù)為7.26 lg（CFU/g），太湖東山地區(qū)所產(chǎn)小龍蝦尾肉菌落數(shù)為7.46 lg（CFU/g）。兩地小龍蝦各部位初始菌落數(shù)的差異可能與產(chǎn)地的地理條件和養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)[25]。

2.2 優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定

對特征菌落進(jìn)行平板劃線，分離得115 株菌。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測16S rRNA 擴(kuò)增產(chǎn)物。成功擴(kuò)增的樣品在1 500 bp 處出現(xiàn)明顯特異性條帶，分析條帶對應(yīng)的菌株序列，進(jìn)行NCBI Blast分析，取同源性大于98%的序列信息，確定種屬[26]。表1 和表2 為浦口、太湖東山小龍蝦各樣品攜帶的115 株特征菌的鑒定結(jié)果，大多菌株屬于腸桿菌科，有35 株屬于檸檬酸桿菌屬。檸檬酸桿菌廣泛存在于自然環(huán)境中，目前已有相關(guān)報道其易感染水產(chǎn)動物[27]。Jaaskelainen 等[28]發(fā)現(xiàn)三文魚中的主要腐敗菌為發(fā)光桿菌屬（Photobacterium beijerinck），金槍魚中的主要腐敗菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）。Zhang 等[29]研究得知鮮草魚片中優(yōu)勢腐敗菌為不動桿菌屬（Acinetobacter）及假單胞菌屬。這些差異可能和物種及產(chǎn)地環(huán)境有關(guān)。

圖1 兩地小龍蝦不同部位的菌數(shù)差異Fig.1 The difference of bacterial counts in different parts of crayfish from two aquaculture farms

表1 浦口地區(qū)小龍蝦不同部位腐敗菌組成Table 1 Composition of spoilage bacteria in different parts of Pukou crayfish

表2 太湖東山地區(qū)小龍蝦不同部位腐敗菌組成Table 1 Composition of spoilage bacteria in different parts of Dongshan crayfish

2.3 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計和OTU 分析

用FLASH 軟件及Trimmomatic 優(yōu)化Illumina Miseq 宏基因組測序法獲取兩產(chǎn)地小龍蝦不同部位樣品菌群的序列信息，18 個小龍蝦樣品共得到1 480 950 條有效序列，序列長度多在200～260 bp之間（圖2a）。由圖2b 可看出，隨著樣品量的增加，當(dāng)序列量在20 000 條以上時，曲線逐漸平坦，說明測序數(shù)據(jù)量充足，具有合理性，足夠體現(xiàn)研究對象的菌群多樣性信息。

2.4 Alpha 多樣性指數(shù)分析

Alpha 多樣性指數(shù)（包括Chao1、PD_whole_tree、observed_species 及Shannon 指數(shù)）分析可以反饋小龍蝦各部位微生物群落的豐度和均勻度。Chao1 及observed_species 指數(shù)能體現(xiàn)菌群豐度（Species richness）。Shannon 指數(shù)可體現(xiàn)符合本研究主題的菌群多樣性（Species diversity），PD_whole_tree 指數(shù)可以體現(xiàn)小龍蝦各部位所含微生物對進(jìn)化歷史的留存差別[30]，如圖3所示。由于Shannon 指數(shù)受菌群豐度和均勻度的影響，能真實反映樣品中菌群的多樣性，因此主要采用Shannon 指數(shù)分析菌群多樣性。從圖中可發(fā)現(xiàn)，太湖東山小龍蝦整體和表面Shannon 指數(shù)的色塊位置較高，而尾肉的色塊位置較低。浦口產(chǎn)地小龍蝦表面Shannon 指數(shù)的色塊位置比整體、尾肉高。表明太湖東山的小龍蝦微生物多樣性高于浦口小龍蝦。除此之外，2 個產(chǎn)地小龍蝦尾肉（帶蝦線）的菌群多樣性指數(shù)均偏低，可能與小龍蝦自身的構(gòu)造有關(guān)。

圖2 序列分布（a）和樣品稀釋曲線圖（b）Fig.2 Sequence distribution and sample dilution curve

圖3 Alpha 多樣性指數(shù)的箱圖Fig.3 The box plots of Alpha diversity indexes

2.5 物種組成和聚類分析

獲取各OTU 對應(yīng)物種分類信息后，在科、屬水平上標(biāo)注不同樣品的微生物菌屬信息。

2.5.1 基于科水平的分析 由圖4 可知，兩產(chǎn)地小龍蝦的初始菌相主要由腸桿菌科、莫拉氏菌科、Family_XII、黃桿菌科和氣單胞菌科5 大菌群組成，每個菌群的相對豐度不低于20%。兩產(chǎn)地小龍蝦各樣品菌相雖有共性，但差異也十分明顯。腸桿菌科作為優(yōu)勢菌群存在于兩產(chǎn)地小龍蝦整體，而Family_XII、黃桿菌科分別是浦口、太湖東山小龍蝦整體的優(yōu)勢菌群。莫拉氏菌科是兩地小龍蝦表面樣品中共同的優(yōu)勢菌群，與整體樣品一致。Family_XII、黃桿菌科也分別是浦口、太湖東山小龍蝦表面的優(yōu)勢菌群。腸桿菌科和氣單胞菌科是兩地小龍蝦尾肉的主要攜帶菌群，而太湖東山小龍蝦尾肉中氣單胞菌科的相對豐度比浦口小龍蝦尾肉樣品高。除此之外，所有樣品中均存在一些豐度高于5%的菌科，如希瓦氏菌屬希瓦氏菌科、擬桿菌科、支原體科、動性球菌科和假單胞菌科。

圖4 基于科水平的菌種組成分析柱狀圖Fig.4 Column chart of bacterial composition analysis based on family level

2.5.2 基于屬水平的分析 從圖5 可以發(fā)現(xiàn)，各樣品微生物多樣性豐富，豐度較高的有黃桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、耶爾森氏鼠疫桿菌屬、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬、擬桿菌屬、穩(wěn)桿菌屬等，兩產(chǎn)地樣品菌相類似，而菌群豐度差異大，其中浦口小龍蝦整體攜帶菌為微小桿菌屬微小桿菌屬、金黃桿菌屬、不動桿菌屬和黃桿菌屬。太湖東山小龍蝦整體攜帶菌主要有黃桿菌屬、氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬和不動桿菌屬。浦口小龍蝦表面攜有不動桿菌屬、微小桿菌屬、金黃桿菌屬和嗜冷桿菌屬。太湖東山表面攜帶黃桿菌屬、氣單胞菌屬、不動桿菌屬和假單胞菌屬。浦口小龍蝦尾肉主要攜帶菌為希瓦氏菌屬、擬桿菌屬、耶爾森氏鼠疫桿菌屬和氣單胞菌屬。太湖東山小龍蝦尾肉含有的微生物有希瓦氏菌屬、氣單胞菌屬、耶爾森氏鼠疫桿菌屬及擬桿菌屬。兩產(chǎn)地小尾肉部位都檢出耶爾森氏鼠疫桿菌屬，且相對豐度較高。耶爾森氏菌分布較廣，容易導(dǎo)致感染對象罹患急性腸胃炎，1 歲以下的嬰幼兒較易感染[31-32]。Keisam 等[33]在印度東北部的魚、豬肉和豆豉等發(fā)酵食品中檢測出耶爾森氏鼠疫桿菌屬。

2.6 樣品菌群多樣性變化的熱圖分析

熱圖可以通過色彩的漸變差異反映表格中最原始的數(shù)據(jù)信息或二維矩陣，聚合18 個樣品的多樣性數(shù)據(jù)，顏色深淺簡潔地展示數(shù)據(jù)梯度，結(jié)果見圖6。圖中的不同樣品根據(jù)污染菌豐度的差異進(jìn)行了聚類，兩產(chǎn)地小龍蝦樣品攜帶的菌群：不動桿菌屬、金黃桿菌屬和氣單胞菌屬等在樣品中的比例大致相同。浦口樣品中嗜冷桿菌屬、微小桿菌屬和耶爾森氏鼠疫桿菌屬的豐度較太湖東山地區(qū)樣品高，而太湖東山樣品中希瓦氏菌屬和假單胞菌屬的相對豐度比浦口地區(qū)樣品高。

圖5 基于屬水平的菌種組成分析柱狀圖Fig.5 Column chart of bacterial composition analysis based on genus level

圖6 OTU 及屬水平熱圖Fig.6 OUT and heatmap map of genus level

2.7 兩地小龍蝦菌群主成分分析

由圖7 可知，第1 主成分（橫軸PC1）與第2主成分（橫軸PC2）的貢獻(xiàn)率分別為43.15%和35.6%。圖中各部位代表點的距離越近，該部位菌群組成相似度越高。兩產(chǎn)地小龍蝦尾肉樣品與小龍蝦整體、表面這2 個部位的距離遠(yuǎn)。兩產(chǎn)地小龍蝦的表面與整體部位距離近，說明養(yǎng)殖環(huán)境（主要是水體環(huán)境）對小龍蝦整體攜帶的菌群多樣性影響程度高。

圖7 不同小龍蝦樣品細(xì)菌菌群的主成分分析Fig.7 Principal component analysis of bacterial flora of different crayfish samples

3 結(jié)論

以不同產(chǎn)地的小龍蝦為研究對象，運(yùn)用Illumina Miseq 宏基因組測序法探究生鮮小龍蝦3 個部位樣品的菌相構(gòu)成。采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離所得污染菌為氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、蜂房哈夫尼菌和克雷伯氏菌屬。宏基因組測序顯示，兩產(chǎn)地小龍蝦所攜帶菌群組成存在差異：浦口新鮮小龍蝦樣品中的微生物主要有不動桿菌屬、氣單胞菌屬、微小桿菌屬、假單胞菌屬和耶爾森氏鼠疫桿菌，太湖東山小龍蝦樣品中微生物菌屬組成相對豐富，主要有氣單胞菌屬、假單胞菌屬、耶爾森氏鼠疫桿菌、希瓦氏菌屬及黃桿菌屬，說明兩產(chǎn)地新鮮小龍蝦攜帶污染菌的菌相構(gòu)成不同。此外，小龍蝦整體與表面的菌群多樣性高于尾肉，說明較多接觸外部環(huán)境的小龍蝦表面所含菌群較為豐富。本研究為今后小龍蝦食品安全質(zhì)量檢測及其保鮮、運(yùn)輸技術(shù)的靶向研究提供理論依據(jù)。