王國(guó)艷，喬國(guó)峰，范建強(qiáng)，黨文慶，何 敏，張國(guó)權(quán)

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太原 030032；2.婁煩縣萬(wàn)順源農(nóng)牧發(fā)展有限公司，山西 太原 030300）

抗生素因能夠防止細(xì)菌性疾病發(fā)生、提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)[1-3]。但抗生素易在動(dòng)物體內(nèi)殘留，引起細(xì)菌等產(chǎn)生耐藥性，因此，尋找綠色的抗生素替代品成為熱點(diǎn)研究方向[2-4]。

枯草芽孢桿菌是一種好氧、嗜溫，并且能夠形成芽孢的細(xì)桿狀細(xì)菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求較低，生長(zhǎng)速度較快[5-7]，能夠在消化道中較為穩(wěn)定地生長(zhǎng)[8]，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制腸道中有害菌群生長(zhǎng)的作用，可促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的免疫器官發(fā)育[9-10]。本試驗(yàn)采集牛場(chǎng)飼料、干草、空氣、水源、糞便等樣品，分離得到菌株并對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

山西省某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)的精補(bǔ)料、青貯飼料、水源、干草、糞便、空氣樣品。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB肉湯液體培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、生化試劑管均（青島生物有限公司）；瓊脂糖（上海生物工程有限公司）。

PCR 引物、各型號(hào)tips（派諾森基因科技有限公司）；dNTP、TaKaRa LA TaqTM 聚合酶（TaKaRa有限公司）。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上將飼料、水、干草分別放入LB肉湯試管，恒溫增菌培養(yǎng)16 h，將增菌液劃線接種于瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16 h；將糞便劃線接種于瓊脂平板，37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)；將牛舍中開(kāi)蓋靜置3 min 的瓊脂平板蓋好蓋子，37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。觀察各平板的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.4 涂片鏡檢

挑取瓊脂平板上有褶皺的單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

1.5 生理生化試驗(yàn)

選取葡萄糖、乳糖、甘露醇、硫化氫等微量生化鑒定管，采用接種針穿刺待檢菌株接種于微量生化鑒定管中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察并記錄。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用KB紙片法，選取阿米卡星、頭孢哌酮、頭孢曲松、氧氟沙星、丁胺卡那、慶大霉素等臨床常用的6種藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)20 h，測(cè)定抑菌環(huán)并記錄結(jié)果。

1.7 16S rDNA PCR基因序列測(cè)定（見(jiàn)表1、表2）

將用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取到的DNA 作為16S rDNA基因PCR擴(kuò)增模板。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，用Primer6.0設(shè)計(jì)16S rDNA引物，由派諾森基因科技有限公司合成[11-12]。引物序列設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物序列設(shè)計(jì)Tab.1 Primer sequence design

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Tab.2 PCR amplification reaction system

反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃終延伸7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)（見(jiàn)圖1）

由圖1可知，肉湯液體渾濁；空氣、水源、飼料、干草的瓊脂平板均無(wú)褶皺型單菌落生長(zhǎng)；糞便接種的普通瓊脂營(yíng)養(yǎng)平板上有乳白色、隆起、褶皺樣菌落生長(zhǎng)。

圖1 瓊脂平板上的菌落Fig.1 Colonies on agar plates

2.2 顯微鏡下的菌落形態(tài)（見(jiàn)圖2）

由圖2 可知，顯微鏡油鏡下觀察為單個(gè)排列的革蘭陽(yáng)性細(xì)長(zhǎng)桿菌。

圖2 顯微鏡下的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology under microscope

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表3）

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]，由表3 可知，待檢菌株的生理生化特性初步符合枯草芽孢桿菌。

表3 生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Biochemical test result

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表4）

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Result of drug sensitivity test

由表5可知，該菌株對(duì)6種藥物均表現(xiàn)出高度敏感，表明該菌株無(wú)耐藥性。

2.5 PCR擴(kuò)增結(jié)果（見(jiàn)圖3）

由圖3可知，得到大小約為1 500 bp的目的條帶。

圖3 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification result

2.6 16S rDNA鑒定結(jié)果

取各個(gè)菌種純化后的PCR 產(chǎn)物，使用測(cè)序儀ABI3730-XL 進(jìn)行DNA 測(cè)序。采用NCBI Blast 程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI 16S 數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，擴(kuò)增序列與NCBI 公布的NR_112686.1 參考株同源性達(dá)99.93%，該分離株為枯草芽孢桿菌。

3 討論

近年來(lái)，為減弱因抗生素濫用造成的細(xì)菌耐藥、DNA污染等危害，益生菌制劑受到廣泛關(guān)注[15]。芽孢桿菌作為一類重要的生物防控菌株，已得到廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用，枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑，具有廣闊的應(yīng)用前景[16-17]。杜漢宇等[18]認(rèn)為，從動(dòng)物機(jī)體及其存活的養(yǎng)殖環(huán)境中分離出來(lái)的益生菌與動(dòng)物保持長(zhǎng)期的共生狀態(tài)，具有相互選擇關(guān)系，易于在該類動(dòng)物機(jī)體內(nèi)定植，因此適合作為生態(tài)制劑加入飼料中。本研究從肉牛場(chǎng)糞便中分離出的枯草芽孢桿菌，可考慮應(yīng)用于肉牛飼料添加劑，為肉牛養(yǎng)殖微生態(tài)飼料添加劑的開(kāi)發(fā)提供候選菌株。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采集肉牛場(chǎng)環(huán)境樣品，符合枯草芽孢桿菌的形態(tài)鑒定，鏡檢為細(xì)長(zhǎng)的桿菌；16S 序列鑒定，PCR 擴(kuò)增條帶為1 500 bp 左右，序列比對(duì)結(jié)果同源性達(dá)99.93%，鑒定為枯草芽孢桿菌。