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UPLC-MS/MS 法同時(shí)測定雙丹膠囊、雙丹顆粒、雙丹口服液中7 種成分

2021-03-07 07:04楊浩天宋浩靜董占軍
中成藥 2021年1期
關(guān)鍵詞:丹皮酚酸口服液

楊浩天,邱 博,宋浩靜,董占軍

(河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部,河北石家莊 050051)

雙丹方由丹參、牡丹皮配伍而成,方中丹參味苦,性微寒,歸心、肝經(jīng),有通經(jīng)止痛之功效;牡丹皮性味歸經(jīng)與丹參相近,可使血涼而不淤,血活而不妄行,兩藥合用時(shí)可增強(qiáng)活血化瘀功效,臨床上常用于治療心脈淤阻所致的冠心病、心絞痛等癥[1]。它因其療效確切而被開發(fā)成多種劑型,包括膠囊、顆粒、口服液[2-3],三者功能主治雖相同,但制劑中兩藥配比、生產(chǎn)工藝等均有所差異。中藥藥效不僅取決于特征成分含量,更受其他活性成分影響,故雙丹方相關(guān)制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理仍值得探討。

丹參活性成分大多為二萜類、酚類衍生物,而牡丹皮中丹皮酚含量較高[4-9],對兩者藥效評價(jià)的研究較多,但配伍過程中其所含成分的結(jié)構(gòu)及含量均發(fā)生變化,而且目前相關(guān)檢測方法大多為HPLC法[9],并不適用于無紫外吸收或痕量物質(zhì)的分析。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法靈敏度高,專屬性強(qiáng),簡便高效,被廣泛地應(yīng)用于中藥復(fù)方活性成分的測定[10-11],故本實(shí)驗(yàn)采用該方法同時(shí)測定雙丹膠囊、雙丹顆粒、雙丹口服液中丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、沒食子酸、原兒茶酸的含量,以期為相關(guān)制劑的質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LC-30A 型超高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu 公司);Triple Quad 5500 型三重四極桿MS 儀,配置Analyst 1.6 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(美國AB Sciex 公司);BP211D 型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];S150 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用型超聲波清洗器(德國Elma 公司);Sorvall ST16R 型高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific 公司);MIULAB MIX-25P 型渦旋儀(杭州米歐儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 丹參酮ⅡA(純度99.5%,批號110766-201721)、丹皮酚(純度99.9%,批號110708-201407)、沒食子酸(純度90.8%,批號110831-201605)、原兒茶酸(純度99.9%,批號110809-201205)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;丹參素(純度98.0%,批號180628)對照品購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司;丹酚酸B(純度98.0%,批號18071704)、迷迭香酸(純度98.0%,批號17081316)對照品均購自上海士鋒生物科技有限公司。雙丹膠囊(廣州萊泰制藥有限公司,批號181007、181104、190414);雙丹顆粒(山東孔圣堂制藥有限公司,批號1901004、1901007、1901105);雙丹口服液(北京九龍制藥有限公司,批號190101、190116、190312)。乙腈、甲酸均色譜純(德國默克公司);水為超純水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 XBridge BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.5 μm);流動(dòng)相乙腈(A)-水(含0.1%甲酸)(B),梯度洗脫(0~2.0 min,5%~30% A;2.0~3.5 min,30%~75% A;3.5~5.5 min,75%~90% A;5.5~6.0 min,90%~5%A;6.0~6.5 min,5%A);體積流量0.5 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI),多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),正負(fù)離子同時(shí)掃描;溫度550 ℃;噴射電壓5 500 V(ESI+)、-4 500 V(ESI-);霧化氣(Gas 1)、加熱氣(Gas 2)壓力55 psi(1 psi=0.133 kPa);氣簾氣壓力35 psi。各成分參數(shù)見表1。

表1 各成分MS 參數(shù)Tab.1 MS parameters for various constituents

2.3 對照品溶液制備 精密稱取丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、沒食子酸、原兒茶酸對照品適量,置于10 mL 量瓶中,乙腈溶解并稀釋至刻度,精密量取適量,50%乙腈稀釋,即得(各成分質(zhì)量濃度分別為1 140.0、2 675.0、2 725.0、1 680.0、488.0、156.0、137.5 ng/mL)。

2.4 供試品溶液制備 取雙丹膠囊內(nèi)容物、雙丹顆粒適量,置于研缽中充分研磨均勻,分別取約500 mg,精密稱定,置于具塞三角瓶中,加入50 mL 50%乙腈,稱定質(zhì)量,超聲提取60 min,放冷,50%乙腈補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,50% 乙腈稀釋100 倍,12 000 r/min 離心10 min,取上清液,即得;精密量取雙丹口服液1 mL,過0.22 μm 微孔濾膜,稀釋1 000 倍,即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 在本實(shí)驗(yàn)所用色譜和質(zhì)譜條件下,各成分峰形良好,且無雜峰干擾,表明方法專屬性強(qiáng)。各成分對照品、供試品色譜圖見圖1。

圖1 各成分LC-MS/MS 色譜圖Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of various constituents

2.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3”項(xiàng)下對照品溶液適量,50% 乙腈稀釋成系列質(zhì)量濃度,在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,并分別以S/N =10、S/N =3 時(shí)為定量限、檢測限,結(jié)果見表2,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下中間質(zhì)量濃度的對照品溶液,在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定6 次,測得丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、沒食子酸、原兒茶酸峰面積RSD 分別為2.1%、1.8%、0.7%、2.4%、1.2%、1.5%、2.6%,表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(雙丹膠囊批號181007,雙丹顆粒批號1901004,雙丹口服液批號190101),于室溫下放置1、2、4、8、16 h 后,在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定,測得雙丹膠囊、雙丹顆粒、雙丹口服液中丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、沒食子酸、原兒茶酸峰面積RSD 分別為1.4%、2.2%、1.7%、3.5%、2.4%、3.7%、2.8%;2.6%、1.9%、3.1%、3.3%、2.8%、1.1%、3.6%;2.3%、4.2%、1.9%、3.0%、1.4%、2.7%、2.5%,表明溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批雙丹膠囊(批號181007)、雙丹顆粒(批號1901004)、雙丹口服液(190101),按“2.4”項(xiàng)下方法各平行制備6 份供試品溶液,在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定,測得雙丹膠囊、雙丹顆粒、雙丹口服液中丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、沒食子酸、原兒茶酸含量RSD 分別為1.4%、2.2%、1.7%、3.5%、2.4%、3.7%、2.8%;2.6%、1.9%、3.1%、3.3%、2.8%、1.1%、3.6%;2.3%、4.2%、1.9%、3.0%、1.4%、2.7%、2.5%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的雙丹膠囊(批號181007)、雙丹顆粒(批號1901004)各250 mg,精密量取雙丹口服液500 μL,各加入對照品溶液500 μL,平行6 份,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算回收率。結(jié)果,雙丹膠囊中丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、沒食子酸、原兒茶酸平均加樣回收率分別為97.9%、101.4%、98.3%、97.1%、102.6%、100.5%、98.2%,RSD 分別為3.6%、2.6%、3.0%、1.8%、2.5%、1.4%、3.1%;雙丹顆粒中各成分平均加樣回收率分別為102.3%、98.1%、101.8%、97.6%、98.3%、102.1%、96.7%,RSD 分別為 2.1%、2.4%、1.1%、3.3%、1.9%、2.5%、3.8%;雙丹口服液中各成分平均加樣回收率分別為99.2%、97.0%、102.5%、100.7%、98.1%、101.9%、99.4%,RSD 分別為3.6%、2.4%、3.7%、1.5%、4.5%、1.8%、2.0%。

2.11 樣品含量測定 取不同批號雙丹膠囊、雙丹顆粒、雙丹口服液各3 批,按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算含量,結(jié)果見表3。

由此可知,3 種制劑、同一制劑不同批次中各成分含量均存在差異,由于制劑在生產(chǎn)過程中的工藝參數(shù)相對固定,故造成上述現(xiàn)象的原因主要為原材料(藥材或飲片)質(zhì)量良莠不齊。中藥品種龐雜,產(chǎn)地廣泛,同名異物、同物異名現(xiàn)象普遍存在,當(dāng)前藥材、飲片、成方標(biāo)準(zhǔn)的制定思路是控制其中1 種或幾種有效或特征成分的含量,而“中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker)”這一概念的提出則完善健全了相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系[12]。

表3 各成分含量測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Results of content determination of various constituents(n=3)

2.12 日均攝入量測定 由于患者服藥后各成分?jǐn)z入量更能真實(shí)地反映中成藥量效關(guān)系,故本實(shí)驗(yàn)結(jié)合藥品說明書及臨床用法用量折算各成分日均攝入量,結(jié)果見表4。由此可知,3 種制劑中各成分日均攝入量差異較大,由高及低依次為雙丹口服液、雙丹顆粒、雙丹膠囊;主要有效成分丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B、丹皮酚總攝入量占比均高于80%,其中丹參酮ⅡA、丹酚酸B 在雙丹顆粒中最高,丹參素、丹皮酚在雙丹口服液中最高,上述現(xiàn)象可歸因?yàn)楦黝愔苿┥a(chǎn)工藝不同。2015 年版《中國藥典》 中雙丹口服液的制備工藝采用水提醇沉法,可較大程度地將有效成分溶出,并且能去除部分雜質(zhì),但對雙丹顆粒、雙丹膠囊劑的制備方法鮮有報(bào)道[13-14]。中藥配伍發(fā)揮療效具有多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn),是一個(gè)復(fù)雜的體內(nèi)過程,故藥物作用強(qiáng)度除了與制劑中主要有效成分含量密切相關(guān)外,其作用方式、生物利用度、不同劑型對其體內(nèi)吸收的影響等因素也會(huì)影響療效[15]。

表4 各成分日均攝入量測定結(jié)果(mg/d, n=3)Tab.4 Results of daily average intake determination of various constituents(mg/d, n=3)

3 討論

3.1 固體制劑提取條件篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了25%、50%、75% 甲醇及25%、50%、75% 乙腈,發(fā)現(xiàn)乙腈提取率略高于甲醇;以50% 或75% 乙腈超聲60 min 時(shí),雙丹膠囊、雙丹顆粒中各成分提取率均高于25%乙腈超聲提取時(shí),并且50%、75%乙腈超聲提取時(shí)差異較小。再考察了超聲時(shí)間30、60、90 min,發(fā)現(xiàn)提取60 min 或90 min 時(shí)各成分提取率均高于提取30 min 時(shí),而提取60、90 min時(shí)無顯著差異。因此,為控制試劑成本,提高實(shí)驗(yàn)效率,確定雙丹膠囊、雙丹顆粒最優(yōu)提取條件為50%乙腈超聲60 min。

3.2 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了不同型號、粒徑的色譜柱,發(fā)現(xiàn) XBridge BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.5 μm)可實(shí)現(xiàn)各成分較好的分離。再考察了乙腈-水、乙腈-水(含0.1% 甲酸)、甲醇-水、甲醇-水(含0.1%甲酸),發(fā)現(xiàn)以乙腈-水(含0.1% 甲酸)梯度洗脫時(shí)可獲得良好的峰形及較快的分析速度,故以其流動(dòng)相。

3.3 質(zhì)譜條件篩選 由于各成分在結(jié)構(gòu)、極性等方面存在差異,故本實(shí)驗(yàn)采用正負(fù)離子模式對其響應(yīng)值進(jìn)行考察。結(jié)果顯示,丹參酮ⅡA 在正離子掃描模式下響應(yīng)更強(qiáng),而丹參素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、沒食子酸、原兒茶酸在負(fù)離子掃描模式下具有更高的響應(yīng)值。為了兼顧各成分測定以使其具有較高的靈敏度,本實(shí)驗(yàn)采用MRM 正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS/MS 法同時(shí)測定雙丹膠囊、雙丹顆粒、雙丹口服液中丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B、丹皮酚、迷迭香酸、沒食子酸、原兒茶酸的含量,該方法靈敏、快速、準(zhǔn)確,可用于相關(guān)制劑的質(zhì)量控制與評價(jià),并為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步研究提供參考。

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