牛沁雅，孟令緣，張艷，李珊珊，施春雷，史賢明，楊保偉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100；2.富平縣檢驗檢測中心（陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心），陜西富平711700；3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240)

0 引 言

阪崎克羅諾桿菌（C ronobacter sakazakii,C.Sakazakii），是一種無芽孢的革蘭氏陰性桿菌，可引起新生兒腦膜炎、敗血癥和腸炎。據(jù)報道，阪崎克羅諾桿菌感染早產(chǎn)嬰兒造成的死亡率可達(dá)到40%～80%[1-9]。雖然前期研究已在嬰幼兒配方乳粉、飲料、奶酪、雞蛋、魚、禽肉、蝦、米飯、餃子、嬰幼兒食品輔料和一些零售食品等中間檢出阪崎克羅諾桿菌，但嬰幼兒配方乳粉（Pow dered In fant Form u la,PIF）被認(rèn)為是該菌最主要、最常見的傳播源及載體[10-17]。

生產(chǎn)過程中PIF可能會被阪崎克羅諾桿菌污染，但細(xì)胞數(shù)一般較少。同時由于PIF中水分活度很低，阪崎克羅諾桿菌即使存在也無法生長繁殖。然而，沖調(diào)的復(fù)溶配方乳粉（R econstituted Pow dered In fant Form ula,RPIF）卻是該菌生長繁殖的良好營養(yǎng)基質(zhì)。日常生活中，很多情況下嬰幼兒不能一次性進(jìn)食完沖調(diào)的RPIF，在一些嬰幼兒護(hù)理中心、醫(yī)院甚至家庭中，醫(yī)護(hù)人員無法做到及時清洗奶瓶，若奶瓶貯藏溫度不適，原本存在于PIF中的少量阪崎克羅諾桿菌則可能在RPIF中快速生長繁殖，從而交叉污染或直接污染再次沖調(diào)的RPIF，導(dǎo)致食源性疾病爆發(fā)[18-21]。

阪崎克羅諾桿菌在RPIF中的遲滯期、剩余RPIF或奶瓶的儲藏溫度、污染菌的細(xì)胞數(shù)量是影響其在RPIF中生長繁殖的決定性因素[22]。為防止食用受到阪崎克羅諾桿菌污染的RPIF，本研究探討了幾個關(guān)鍵的培養(yǎng)參數(shù)對4、15、25、37℃（分別代表剩余RPIF和奶瓶在冰箱及不同季節(jié)室溫儲存的溫度）下RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響，預(yù)測阪崎克羅諾桿菌在RPIF中的生長規(guī)律，以便為有效減少醫(yī)院及家庭環(huán)境中相關(guān)病原菌的污染風(fēng)險提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株C ronobacter sakazakii ATCC BAA 894，由中國食品藥品檢定研究院提供，用于生長曲線測定以及初級、二級模型建立。

1.1.2 試劑

Luria-Bertani Agar（LB）和 Brian Heart In fusion（BH I）培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；嬰幼兒配方乳粉由市場購買生產(chǎn)日期為同批次的某品牌金裝幼兒配方粉。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LAC-5080S高壓滅菌鍋，上海博訊；SW-CJ-1CU超凈工作臺，蘇州泰安；NU-425-400E生物安全柜，美國；微量移液槍，德國Effendorf；MIR-253-20℃超低溫冰箱，日本三洋；MDF-3286S-80℃超低溫冰箱，日本三洋；Q L-86旋渦振蕩器，其林貝爾；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏；XS204百分之一天平，梅特勒；78-1磁力攪拌器，常州國華；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴箱，天津泰斯特；BCD-205TA 4℃冰箱，青島海爾；ZHWY-211B搖恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與菌落計數(shù)

將-80℃保存的菌液劃線于LB平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取一單菌落接種于200 m L BH I肉湯培養(yǎng)基，37℃、100 r/min搖床培養(yǎng)18～24 h。

通過菌落計數(shù)法確定BH I培養(yǎng)基中阪崎克羅諾桿菌的初始濃度[23]。吸取1 m L的BH I培養(yǎng)物加入9 m L的生理鹽水中進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇2～3個適宜的稀釋度，取1 m L稀釋液涂布于LB平板，每個稀釋度設(shè)3個平行，37℃培養(yǎng)24 h，選取菌落數(shù)在30～300之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)，最終濃度以每毫升菌液的菌落形成單位（Co lony Forming Unit,CFU）平均值表示。

1.2.2 RPIF制備

根據(jù)奶粉外包裝袋上的使用說明沖調(diào)乳粉溶液。稱取30 g乳粉于120 m L滅菌水中，攪拌直至完全溶解。復(fù)溶乳粉分裝至50 m L離心管中，每管10m L，121℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.2.3 阪崎克羅諾桿菌生長曲線測定

將0.1 m L菌液接入分裝好的無菌RPIF中，接種菌液的終濃度控制在103～104CFU/m L。RPIF分別置于4、15、25、37℃條件下培養(yǎng)，測定不同培養(yǎng)時間下阪崎克羅諾桿菌的活菌數(shù)。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.4 初級模型建立

選取Gom pertz方程和Logistic方程2種初級模型預(yù)測菌株生長規(guī)律。

Gom pertz方程為公式（1）

該方程用于計算阪崎克羅諾桿菌在測試溫度下的遲滯時間λ（h），最大生長速率μm（h-1），培養(yǎng)時間無限增加時細(xì)菌數(shù)量的增量（A）[24-25]。

Logistic方程為公式（2）：

式中，C為活菌總數(shù)（CFU/m L），Cmax為最大活菌總數(shù)。

1.2.5 二級模型建立

根據(jù)細(xì)胞活菌數(shù)量化溫度對生長速率及遲滯時間的影響，模擬構(gòu)建生長模型。以修正的Gom pertz方程作為主要生長模型，得出與生長相關(guān)關(guān)鍵參數(shù)[24]。二次模型構(gòu)建時，用R atkow sky平方根模型[26]和二次R osso模型[27]評估不同溫度下阪崎克羅諾桿菌的最大生長速率。使用R atkow sky模型和雙曲線方程反算結(jié)果的對數(shù)與遲滯期的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合[28]。

為了評估貯藏溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響，研究采用平方根模型擬合溫度與最大生長速率μmax，使用預(yù)測值和試驗值之間的殘差以及比較用的溫度預(yù)測模型進(jìn)行驗證。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Curve Expert1.4軟件對生長曲線進(jìn)行分析，利用Microsoft excel 2010建立二級預(yù)測模型，采用平方根模型擬合菌株最大生長速率μmax，評價貯藏溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響。

2 結(jié) 果

2.1 RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長曲線

阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA894在RPIF中4℃培養(yǎng)72 h后的生長曲線不符合S型，見圖1a，表1。在15、25、37℃下培養(yǎng)后，采用Gom pertz、Logistic模型進(jìn)行擬合，見表1，表2。各擬合方程的標(biāo)準(zhǔn)差和相關(guān)系數(shù)表明，與Logistic模型相比，Gom pertz方程擬合的一級生長模型較好。

圖1 不同溫度下阪崎克羅諾桿菌的生長曲線

表1 RPIF中阪崎克羅諾桿菌在4、15、25、37℃下的生長 log(CFU·m L-1)

表2 RPIF中阪崎克羅諾桿菌在15、25、37℃下的參數(shù)及Gompertz模型

Gom pertz模型顯示，在15、25、37℃培養(yǎng)時，RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長規(guī)律遵循單細(xì)胞微生物典型的S型生長曲線，見圖1b、c、d。在一定培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，溫度越高，阪崎克羅諾桿菌生長繁殖越快，到達(dá)最大生長速率所需時間t1、到達(dá)穩(wěn)定期所需時間t2及遲滯時間λ越短，最大生長速率μm越高，見表3。

2.2 溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長的影響

繪制R atkow sky平方根模型可反應(yīng)最大生長速率的平方根與溫度間的關(guān)系。其形式為：b(T-Tmin)，b為系數(shù)，Tmin為理論最低生長溫度，即回歸線延長線與溫度軸相交所得的溫度。結(jié)果表明，溫度升高，最大生長速率的平方根同步增加，見圖2。最優(yōu)擬合的二級模型中的參數(shù)見表4，具體方程如下：

對阪崎克羅諾桿菌生長速率模型的準(zhǔn)確性驗證后，殘差檢驗結(jié)果表明RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長速率殘差均在±0.05之間，即預(yù)測模型在α=0.05水平可信，見圖3。實測值與預(yù)測值對比檢驗結(jié)果表明，阪崎克羅諾桿菌生長速率實測值與預(yù)測值較為接近，預(yù)測結(jié)果可靠，見圖4。使用準(zhǔn)確性因子與偏差性因子對預(yù)測值和實測值分析后，所得偏差性因子的值為1.0096，準(zhǔn)確性因子的值為0.9905，均符合模型可接受條件的要求，即該模型可較好反映沖調(diào)奶粉中阪崎腸桿菌在不同溫度下生長速率的高低，見表5。研究獲得的方程式可以用來預(yù)測RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長，以避免食用PIF的感染風(fēng)險。

表3 RPIF中阪崎克羅諾桿菌在15、25、37℃下Gompertz模型參數(shù)

圖2 溫度對RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長影響的平方根模型

表4 RPIF中阪崎克羅諾桿菌的平方根模型參數(shù)

圖3 RPIF中阪崎克羅諾桿菌生長速率殘差

圖4 RPIF中阪崎克羅諾桿菌在15、25、37℃下生長速率的實際值與預(yù)測值比較

表5 阪崎克羅諾桿菌生長速率實測值與預(yù)測值分析

3 討 論

RPIF是阪崎克羅諾桿菌生長的良好物質(zhì)，因此應(yīng)在PIF加工和食用過程中嚴(yán)格控制和預(yù)防該致病菌[2,29]。日常生活中，有些嬰幼兒在飲用RPIF時并不能一次性飲用完，家長可能會將其放置于4℃冰箱或室溫保存，以供嬰幼兒再次飲用。還有些情況下，嬰幼兒飲用完畢的奶瓶并沒有及時清洗，而是放置于室溫，這剛好是PIF中可能存在的少量阪崎克羅諾桿菌大量生長繁殖的良好條件，結(jié)果導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全問題。本研究探討了RPIF中阪崎克羅諾桿菌在4、15、25、37℃下的生長情況，以此模擬RPIF或奶瓶貯存于冰箱及室溫的環(huán)境溫度，預(yù)測、評估未飲用完的RPIF和未立即清洗的空奶瓶的安全性。

阪崎克羅諾桿菌在RPIF中生長一級模型的建立一定程度反映了該菌的生長規(guī)律。Fakruddin等[30]采用Gom pertz模型對10.0～40.0℃下RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長進(jìn)行擬合，經(jīng)評價后發(fā)現(xiàn)Gom pertz模型擬合效果好，適合描述不同溫度下阪崎克羅諾桿菌的生長。邱紅玲[31]等研究者也指出修正的Gom pertz能較好地擬合復(fù)原乳中3種致病菌在4～42℃或者25～42℃條件下的生長動力學(xué)參數(shù)。與以上研究結(jié)果相似，本研究顯示采用Gom pertz、Logistic模型進(jìn)行擬合，各擬合方程的標(biāo)準(zhǔn)差和相關(guān)系數(shù)表明Gom pertz方程擬合的一級生長模型更好。

RPIF中的阪崎克羅諾桿菌開始生長的遲滯期長短不僅取決于環(huán)境，還取決于其處于何種生長階段[32]。根據(jù)對生長數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)，雖然在RPIF中接種穩(wěn)定期的阪崎克羅諾桿菌，但15、25、37℃下其生長曲線均呈現(xiàn)S型且遲滯期較短。Kandhai等研究者對RPIF中不同生長階段的阪崎克羅諾桿菌的生長曲線進(jìn)行Gom pertz模型擬合，研究表明預(yù)培養(yǎng)條件不會影響RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長速率或遲滯期，并且遲滯期通常很短[33]。另一研究顯示，盡管在10℃儲藏RPIF可以觀察到明顯的遲滯期，但升高溫度至25、37、45℃并不能觀察到明顯的遲滯期[34]。與預(yù)培養(yǎng)時間和溫度對生長速率和遲滯期的影響相似，其他結(jié)果表明，接種量（即高或低接種量）和RPIF組成對阪崎克羅諾桿菌的生長也沒有影響[2]，這可能由于RPIF營養(yǎng)豐富，阪崎克羅諾桿菌較短時間可內(nèi)適應(yīng)生長環(huán)境。以上結(jié)果表明，如果未正確保存剩余的RPIF或未及時清洗奶瓶，將有可能感染阪崎克羅諾桿菌，并對嬰幼兒構(gòu)成巨大的潛在危害。

溫度是影響RPIF中阪崎克羅諾桿菌的生長的因素之一。本研究通過建立二級模型并對阪崎克羅諾桿菌的生長速率和相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了殘差檢驗、實測值與預(yù)測值對比檢驗以及準(zhǔn)確性因子與偏差性因子檢驗，其中準(zhǔn)確性因子可用于衡量預(yù)測值和實測值之間的接近程度，越接近1表示模型準(zhǔn)確性越高，Braun等[35]認(rèn)為準(zhǔn)確性因子值在1.1～1.9之間，模型均可接受。G iffel等[36]認(rèn)為偏差性因子值在0.75～1.25之間，模型可被接受，R oss等[37]認(rèn)為偏差性因子值在0.9～1.05之間，模型可靠性較高。研究結(jié)果表明二級模型預(yù)測結(jié)果可靠，隨著溫度升高，RPIF中的阪崎克羅諾桿菌最大生長速率也會增加。Fang等通過生長動力學(xué)模型的建立及比較發(fā)現(xiàn)，在RPIF中，未經(jīng)熱處理的菌株生長溫度范圍為6.5～51.4℃，熱處理菌株的生長溫度范圍為6.9～50.1℃，未經(jīng)熱處理和熱損傷的菌株的生長速率無顯著差異[38]。Kandhai等研究發(fā)現(xiàn)57株阪崎克羅諾桿菌中有50株在47℃下可以生長，但在4℃下均無生長，腦心浸肉湯（BH I）中阪崎克羅諾桿菌的最低生長溫度為5.5～8℃[33,39]。與早期研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)RPIF中阪崎克羅諾桿菌在4℃下可存活72 h且菌量穩(wěn)定，這一溫度相當(dāng)于部分地區(qū)冬季的室外溫度，也相當(dāng)于冰箱儲存溫度。結(jié)果顯示，如果剩余RPIF儲存在冰箱或更低溫度下，不會被阪崎克羅諾桿菌或低濃度阪崎克羅諾桿菌污染，無法造成感染，則剩余的RPIF仍可以飲用。

阪崎腸桿菌是一種條件性致病菌，對特殊人群的致死率甚至高達(dá)40%～80%。2003年P(guān)agotto等首次研究指出，腹腔注射阪崎克羅諾桿菌劑量為×108CFU/m L的RPIF時，對乳鼠具有致死作用[40]。2012年徐桂香等研究表明，將×108CFU/m L的野生阪崎克羅諾桿菌腹腔注射出生三日的SD乳鼠，平均致死時間為6.5 h，且記錄了不同注射劑量實驗動物組死亡情況，結(jié)果顯示野生阪崎克羅諾桿菌的半致死劑量為3.162×106CFU[41]。由于關(guān)于阪崎克羅諾桿菌對人致病的安全限量和相關(guān)毒力因子的信息有限，因此，所有的阪崎克羅諾桿菌都被視為潛在的病原體。本研究的結(jié)果可以預(yù)測4個季節(jié)不同溫度下，阪崎克羅諾桿菌RPIF中的生長情況，有助于建立有效的食品安全控制措施。