張志峰，王子杏,2，李殿梅，嚴(yán)逸倫，殷 霞，范 軍*，章偉光*

(1. 華南師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣州 510006； 2. 廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，廣州510663)

原料藥、賦形劑、輔料、藥品在生產(chǎn)和保存過程中與設(shè)備、儲存容器等接觸，可能將元素雜質(zhì)帶入藥物中. 由于某些金屬或非金屬雜質(zhì)表現(xiàn)出慢性毒理學(xué)風(fēng)險，近年來對藥品中元素雜質(zhì)的含量提出了新的要求[1-2]. 為了保障原料藥和制劑的質(zhì)量，國際人用藥物注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會議(ICH)制訂了一系列關(guān)于藥品質(zhì)量控制的指南，其中ICH-Q3D元素雜質(zhì)指南為口服、注射和吸入制劑中的24種元素雜質(zhì)制訂允許日暴露量(Permitted Daily Exposure，PDE)的標(biāo)準(zhǔn).

目前，離子色譜法、原子吸收光譜法、火焰光度法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體光譜法(ICP-OES)等已被廣泛應(yīng)用于元素含量分析領(lǐng)域[3-5]. ICP-OES具有多元素同時分析、檢出限低(達(dá)ppb級)、靈敏度高、動態(tài)線性范圍寬、準(zhǔn)確度和精密度良好、使用范圍比電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)更廣的優(yōu)點. 2018年，MENOUTIS等[6]采用軸向ICP-OES對口服藥物中17種低含量的元素雜質(zhì)進(jìn)行測定，使用超聲霧化器配合水平觀測模式代替ICP-MS. 2019年，PINHEIRO等[7]采用ICP-OES對液體藥物樣品的元素雜質(zhì)進(jìn)行分析，采用內(nèi)標(biāo)和單點標(biāo)準(zhǔn)加入法等校準(zhǔn)策略有效地校正了基質(zhì)效應(yīng)；對卡馬西平、鹽酸阿米替林或乙酰水楊酸等難消解的藥物，則提出采用微波誘導(dǎo)消解樣品后進(jìn)行分析檢測的方法[8-9].

氟氯西林鈉是一種半合成的耐青霉素酶的青霉素類抗生素，其結(jié)構(gòu)與臨床使用較多的氯唑西林、雙氯西林、苯唑西林等類似，具有比青霉素更廣的抗菌譜，主要用于治療敏感的革蘭陽性菌引起的皮膚及軟組織感染、呼吸道感染及其他感染，亦是耐藥菌產(chǎn)生的嚴(yán)重疾病的首選治療藥物[10].

注射用氟氯西林鈉屬于胃腸外給藥，ICH-Q3D指南中對元素雜質(zhì)含量有著嚴(yán)格要求. 目前尚未見注射用氟氯西林鈉藥物中元素雜質(zhì)檢測的報道. 在本研究中，參考美國藥典USP<233>方法微波消解注射用氟氯西林鈉樣品，再采用ICP-OES建立了一種分析方法，用于檢測鋁、硼、鈣、鐵、錳、鉀、鎂、鋅、鈦、硅、砷、鎘、鉛、鈷、鋇、鉻、鋰和銻等18種元素雜質(zhì)，優(yōu)化了儀器參數(shù)，通過加標(biāo)回收率確定其觀測模式. 本方法的靈敏度和重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、分析速度快，為注射用氟氯西林鈉中元素雜質(zhì)的檢測和質(zhì)量控制提供了參考.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器：電感偶合等離子體發(fā)射光譜儀(ICAP7000，美國Thermofisher Scientific)、微波消解儀(Multiwave PRO，德國Anton Paar).

主要試劑：鋁、硼、鈣、鐵、錳、鉀、鎂、鋅、鈦、硅、砷、鎘、鉛、鈷、鋇、鉻、鋰和銻等18種元素標(biāo)準(zhǔn)溶液購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心，質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L；濃硝酸和雙氧水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)為分析純. 注射用氟氯西林鈉(規(guī)格分別為0.25、0.5和1.0 g)的結(jié)構(gòu)見圖1. 實驗用水為超純水，通過超純水儀(美國Millipore)制得.

圖1 氟氯西林鈉的分子結(jié)構(gòu)

1.2 樣品的微波消解

精密稱取注射用氟氯西林鈉樣品(1.0 g)，置于消解罐中，加入濃硝酸(9 mL)在140 ℃下預(yù)消解15 min；再加入1 mL濃硝酸，冷卻后，將其放入微波消解儀中，采用表1所列的消解程序進(jìn)行消解. 待消解完成后，將裝有消解樣品的消解罐在120 ℃下加熱濃縮以去除殘余硝酸，最終將消解后的樣品溶液濃縮至近1 mL. 將其轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容，搖勻備用. 同時，進(jìn)行空白實驗，以消除可能的雜質(zhì)污染[11-14].

表1 微波消解程序Table 1 The microwave digestion program

1.3 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 Pb、Co、As和Cd混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精密量取鉛元素標(biāo)準(zhǔn)溶液400 μL、鈷元素標(biāo)準(zhǔn)溶液400 μL、砷元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 200 μL和鎘元素標(biāo)準(zhǔn)溶液160 μL，置于10 mL量瓶中，定容后搖勻，得到Pb、Co、As和Cd混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度分別為 40、40、120和16 mg/L.

1.3.2 總混標(biāo)溶液的配制 精密量取Pb、Co、As和Cd混合溶液250 μL，Al、B、Ca、Fe、Mn、K、Mg、Zn、Ti和Si等元素標(biāo)準(zhǔn)液各2 600 μL，鋇標(biāo)準(zhǔn)溶液1 400 μL，鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液2 200 μL，鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL，銻標(biāo)準(zhǔn)溶液180 μL，混合在一支容積為50 mL的容量瓶中，定容后得到總混標(biāo)溶液，其中，Pb、Cd、Co、As的質(zhì)量濃度分別為0.20、0.08、0.20和0.60 mg/L，Al、B、Ca、Fe、Mn、K、Mg、Zn、Ti、Si的質(zhì)量濃度均為52.00 mg/L，Ba、Cr、Li、Sb的質(zhì)量濃度分別為28.00、44.00、10.00和3.60 mg/L.

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制 精密量取上述總混標(biāo)溶液0、0.50、1.25、2.50、3.75和5.00 mL分別置于容積為50 mL的容量瓶中，定容后得到各元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液.

1.3.4 系統(tǒng)適應(yīng)性溶液的配制 精密量取總混標(biāo)溶液1.25 mL置于50 mL量瓶中，定容得到系統(tǒng)適應(yīng)性溶液.

1.3.5 檢測限和定量限溶液的配制 以空白樣品消解后的溶液連續(xù)進(jìn)樣11次，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢測限和定量限[6].

LOD=3×SD/k，

LOQ=10×SD/k，

其中，LOD和LOQ分別為各元素的定量限和檢測限(mg/L)，SD為響應(yīng)強度值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為線性方程中的斜率，通過實驗確定.

1.3.6 加標(biāo)回收率溶液的配制 精密稱取供試品9份，每份1.0 g，按照1.2所述方法進(jìn)行消解，按限度質(zhì)量濃度的80%、100%和120%分別加入1.3.2所述總混標(biāo)溶液5.00、6.25和7.50 mL. 將其作為低、中、高濃度的加標(biāo)供試品溶液，采用ICP-OES測定方法進(jìn)行加樣回收試驗.

1.4 儀器的工作參數(shù)與測定方法

1.4.1 儀器的操作條件及參數(shù) 霧化器流量為0.50 L/min，等離子體流量為12.0 L/min，輔助氣流量為0.5 L/min，蠕動泵轉(zhuǎn)速為50 r/min，RF功率為1.15 kW，進(jìn)樣延時30 s，穩(wěn)定時間為20 s，讀數(shù)時間為5 s，重復(fù)讀數(shù)次數(shù)為3次. 背景扣除：左右背景. 經(jīng)優(yōu)化后各元素的波長(nm)分別為：396.152(Al)、212.412(Si)、249.772(B)、189.042(As)、317.933(Ca)、226.502(Cd)、259.940(Fe)、220.353(Pb)、257.610(Mn)、228.616(Co)、766.490(K)、230.424(Ba)、279.553(Mg)、267.716(Cr)、213.856(Zn)、670.784(Li)、336.121(Ti)和206.833(Sb).

1.4.2 測定方法 采用外標(biāo)法對各元素進(jìn)行定量測定. 在上述電感耦合等離子體最佳條件下，分別對標(biāo)準(zhǔn)曲線、空白樣品和待測樣品進(jìn)行分析，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量.

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)的適應(yīng)性

將系統(tǒng)適應(yīng)性溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，結(jié)果見表2. 所測得元素質(zhì)量濃度的RSD最大為5.89%，說明系統(tǒng)適應(yīng)性良好.

表2 系統(tǒng)適應(yīng)性及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 The results of system adaptability and the RSDs(n=6)

2.2 ICP觀測模式對元素加標(biāo)回收率的影響

在ICP-OES研究中，水平觀測模式具有靈敏度高和檢測限低的優(yōu)點而被優(yōu)先采用. 首先采取水平觀測模式測定18種元素的質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)K和Li元素的加標(biāo)回收率出現(xiàn)異常，其他元素的加標(biāo)回收率結(jié)果在80%～110%之間. 因此，對比研究了水平觀測模式和垂直觀測模式對K和Li元素加標(biāo)回收率的影響(表3). 采用垂直觀測模式時，氟氯西林鈉樣品中K和Li元素的加標(biāo)回收率均在103.2%～105.0%和98.6%～105.0%之間，RSD分別為1.08%和0.78%；采用水平觀測模式時，K和Li元素的加標(biāo)回收率在132.5～138.1%和75.1%～77.0%之間，RSD分別為2.07%和1.34%. 顯然，采用水平觀測模式時2種元素的加標(biāo)回收率偏差遠(yuǎn)大于采用垂直觀測模式，后者更適于K和Li元素的檢測. 這是因為K和Li元素較易電離，等離子體尾焰對易電離元素有明顯的干擾. 采用垂直觀測模式時，光譜儀橫向穿過等離子體[15]，雖然檢測限略有降低，但顯著降低了等離子體尾焰對易電離元素的干擾，顯著改善了復(fù)雜有機樣品基質(zhì)下的電離效應(yīng).

表3 不同觀測模式下K、Li元素的加標(biāo)回收率結(jié)果及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 The recovery results and RSDs (n=3) of K and Li elements under different observation modes

2.3 方法的線性、檢出限和定量限

按各元素限度質(zhì)量濃度的0～160%設(shè)計線性范圍，考察線性關(guān)系、檢測限和定量限等，結(jié)果見表4. 各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)在0.998以上，且各元素的LOD和LOQ結(jié)果能滿足注射用氟氯西林鈉藥物中元素雜質(zhì)的限度要求.

表4 線性相關(guān)系數(shù)、線性方程、檢出限及定量限結(jié)果Table 4 The linear correlation coefficient, regression equation, LOD and LOQ

2.4 重復(fù)性、中間精密度及加標(biāo)回收率

考慮到注射用氟氯西林鈉樣品中各元素雜質(zhì)的質(zhì)量濃度極低，采用在樣品中加標(biāo)方式進(jìn)行重復(fù)性和中間精密度實驗，加標(biāo)量為100%限度質(zhì)量濃度，結(jié)果見表5. 重復(fù)性和中間精密度的RSD分別小于4.05%和9.39%，符合USP<233>中重復(fù)性及中間精密度實驗RSD小于25%的要求[16]. 在按限度質(zhì)量濃度80%、100%和120%加標(biāo)實驗中，18種元素的加標(biāo)回收率均在82.9%～105.7%之間，其RSD小于4.65%.

表5 平均加標(biāo)回收率、重復(fù)性和中間精密度結(jié)果Table 5 The average recovery, repeatability and intermediate precision

續(xù)表5

2.5 ICP-OES檢測氟氯西林鈉樣品中的元素雜質(zhì)

采用微波消解和ICP-OES方法對某公司生產(chǎn)的規(guī)格分別為0.25、0.50和1.00 g、各3批次(標(biāo)記為1、2和3)的注射用氟氯西林鈉樣品中進(jìn)行元素雜質(zhì)測定. 從說明書可知，注射用氟氯西林鈉的每日最大用量為4.0 g. 氟氯西林鈉藥品中各元素雜質(zhì)的限度質(zhì)量濃度:LC=PDE/(mV)，其中，LC為某元素雜質(zhì)的限度質(zhì)量濃度(mg/L)，PDE為某元素雜質(zhì)的每日允許暴露量(μg/d)，m為氟氯西林鈉每日最大用量(g)，V為稀釋體積(100 mL).

表6中的結(jié)果表明，在各規(guī)格不同批次的注射用氟氯西林鈉產(chǎn)品中18種元素雜質(zhì)的質(zhì)量濃度存在差異，但均低于ICH-Q3D中對注射用藥元素雜質(zhì)的限度要求.

表6 注射用不同規(guī)格氟氯西林鈉樣品中各元素的質(zhì)量濃度Table 6 The concentration distribution of 18 elemental impurities in flucloxacillin sodium for injection mg/L

3 結(jié)論

基于ICP-OES技術(shù)，按照USP標(biāo)準(zhǔn)要求，建立了一種注射用氟氯西林鈉樣品中18種元素雜質(zhì)的檢測方法，考察了觀測模式對K和Li元素的加標(biāo)回收率的影響. 結(jié)果表明：采用垂直觀測模式可顯著地降低電離效應(yīng)對測定K和Li元素的影響. 本方法具有良好的線性、靈敏度、中間精密度和準(zhǔn)確度. 對某企業(yè)提供的氟氯西林鈉樣品進(jìn)行元素雜質(zhì)的測定，各元素雜質(zhì)的質(zhì)量濃度符合國家藥典制定的要求.