張春雪 ，魏孝承 ，王晗陽 ，2，鄭向群 ，楊 波

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2.天津城建大學，天津 300384）

近年來，中國水環(huán)境污染加劇，水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象已成為一個不容忽視的環(huán)境問題之一［1］，由此引發(fā)的藻類水華頻發(fā)等現(xiàn)象是水體富營養(yǎng)化的主要表現(xiàn)形式［2］。其中，藍藻水華在影響水生生態(tài)系統(tǒng)協(xié)調(diào)與穩(wěn)定性的同時，其次生代謝產(chǎn)物藻毒素對其他水生植物、動物甚至人類的健康產(chǎn)生巨大影響［3］。生物修復富營養(yǎng)化水體的方法因其經(jīng)濟性和環(huán)境友好性成為當前國內(nèi)外研究的熱點。在以往的研究中，生物操縱對藍藻水華的抑制均取得了一定成效，但在一些試驗和應用中并未得到預期效果［4，5］。究其原因，一方面，水生動物排泄會使營養(yǎng)鹽上升，且其對藻毒素的耐性仍存在爭議；另一方面，部分水生動物會吞食浮游動物，對控制藻類生長產(chǎn)生負面影響。因此，進一步開發(fā)聯(lián)合修復技術，降低負面影響，成為現(xiàn)階段亟需解決的問題。

近年來，在生態(tài)修復實踐中，采用2 種或2 種以上水生生物聯(lián)合修復富營養(yǎng)化水體的技術受到廣泛關注。Zhou 等［6］采用菹草（Potamogeton crispus）進行模擬修復試驗，結果表明，在種植菹草的試驗水體中總氮（TN）、總磷（TP）、葉綠素含量等指標均發(fā)生大幅度下降，并且在試驗結束時菹草可改變浮游植物的群落結構，使之由綠藻為主，變?yōu)樗{藻、綠藻以及底棲藻類共存的良好狀態(tài)。Zhao 等［7］在實驗室可控條件下，提取金魚藻的化感物質(zhì)，通過提取液和普通小球藻（Chlorella vulgaris）的共培養(yǎng)試驗證明，金魚藻提取液不僅能夠顯著抑制小球藻的生長，并且對小球藻的形態(tài)也有影響，加入金魚藻提取液的培養(yǎng)組內(nèi)小球藻細胞呈現(xiàn)松散、破裂的情況。Zhang 等［8］選用苦草（Vallisneria natans）、金魚藻（Ceratophyllum demersum）與綠藻門的剛毛藻（Cladophora）進行共培養(yǎng)試驗，結果表明，苦草和金魚藻這2 種沉水植物對剛毛藻的生長具有顯著抑制效果。李啟升等［9］采用室內(nèi)可控試驗，研究不同氮負荷對苦草和狐尾藻（Myriophyllum aquaticum）生長的影響，每日將含N 25 μg/L 和 500 μg/L 的營養(yǎng)液輸入試驗水體，以此來模擬高、低N 負荷，結果表明，在高、低N 負荷下，苦草和狐尾藻的存在均可以明顯降低水中氨氮、硝氮濃度，并且高N 負荷對于狐尾藻的株高、生長率等指標均無顯著影響，表明二者在較高的N 負荷下依舊可以發(fā)揮凈水作用，并且狐尾藻表現(xiàn)出較好的N 耐性，說明其可以應用在較高N 濃度的水體修復中。邢春玉等［10］選用荇菜（Nymphoides peltatum）、苦草、黑藻（Hydrilla verticillata）和穗花狐尾藻（Myriophyl?lum spicatum）4 種天津市較為常見的水生植物對處于藍藻暴發(fā)期的海河水體進行處理，結果表明，4 種植物均對藍藻有很好的抑制效果，且其對水體pH、溶解氧以及溫度變化具有良好的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)有研究中對生物操縱已有一定的成果［11-13］，但對于生物操縱是否能夠有效抑制產(chǎn)毒藍藻，濾食性動物在修復水體時的添加密度是否會影響其對水華的抑制作用，水生植物修復和生物操縱能否完全相輔相成，此類生物修復過程中對水體浮游細菌群落結構會造成的影響等問題，仍需進一步討論和研究。本研究基于生物操縱理論和水生植物修復理論，結合目標水體現(xiàn)狀，采用大型溞作為濾食性動物的代表，狐尾藻和金魚藻作為沉水植物的代表，在實驗室可控條件下，模擬春夏水華易發(fā)生時期的自然狀態(tài)，設計9 個試驗處理，研究單一生物及其組合對富營養(yǎng)化水體的修復作用，并對其修復機理進行初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試大型溞購自中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所；供試植物為狐尾藻和金魚藻，購自天津市某花鳥魚蟲市場；富營養(yǎng)化水體取自天津市寧河區(qū)某農(nóng)田周邊的池塘。

水體初始水質(zhì)為pH 8.77、溶解氧（DO）9.28 mg/L、透明度17.20 cm、TN 7.38 mg/L、TP 0.31 mg/L、NH4+-N 0.21 mg/L、硝氮（NO3--N）6.59 mg/L、葉綠素 a 68.59μg/L、浮游植物密度 2.80×107cells/L、藍藻門密度2.52×107cells/L、微囊藻毒素2.77 μg/L。

1.2 試驗設計

試驗設9個處理，分別為對照（CK）；高（100 ind/L）、低（25 ind/L）2 種大型溞密度處理，研究不同密度大型溞對試驗水體的影響；2 種沉水植物金魚藻、狐尾藻處理，研究不同沉水植物對試驗水體的影響；2 種沉水植物和2 種密度大型溞分別組合處理，研究草-溞聯(lián)合對試驗水體的影響，詳見表1。每處理均設3個重復，容器體積為20 L，試驗時間為20 d。

表1 試驗設置

1.3 樣品的采集

在試驗2、5、10、15、20 d 時進行水樣采集，采樣時間為上午8：00—9：00。為減少試驗誤差，在每次取樣后記錄水位，在下次取樣前采用去離子水補足蒸發(fā)量［14］。

1.4 樣品的測定

1）透明度。采用鉛字法測定。

2）浮游植物密度。移液槍吸取濃縮后的浮游植物樣品1 mL，采用0.1 mL 浮游植物計數(shù)框于奧林巴斯顯微鏡400×下定量計數(shù)，每個樣品計數(shù)3 片后取平均值，浮游植物種類鑒定參考《中國淡水藻類：系統(tǒng)、分類及生態(tài)》［15］，浮游植物的密度參考章宗涉等［16］的研究方法，具體計算公式如下。

式中，N為每升樣品中的浮游植物數(shù)量，V為采樣體積，Vs為原水樣濃縮后的體積，n為鏡檢計數(shù)所得的浮游植物數(shù)目，Va為計數(shù)框容量。

3）葉綠素 a 含量。采用丙酮法萃?。?7］測定水體中的葉綠素a（chla），計算公式如下。

式中，ρs為樣品中 chla 的質(zhì)量濃度，A為吸光度。

式中，ρw為試驗水體中葉綠素a 的質(zhì)量濃度，ρs為樣品中葉綠素a 的質(zhì)量濃度，V1為離心管中溶液的體積，V為水樣的體積。

4）微囊藻毒素。采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測［18］，同一樣本測定3 個平行樣后取平均值。

5）大型溞密度。使用玻璃棒攪拌混勻水體，取1 L 水樣采用3%的甲醛溶液固定并濃縮至50 mL，采用1 mL 計數(shù)框于顯微鏡100×下定量計數(shù)，每個樣品均計數(shù)3 次后取平均值。

6）植物濕重。將各試驗桶中的水生植物取出，用濾紙吸干表面的水分后，采用電子天平稱重，每個樣品稱3 次取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各項指標采用Origin 9.0制圖，數(shù)據(jù)均以3個平行試驗桶的平均值±標準差形式表示。采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析，通過單因素方差分析（one-way/ANOVA）檢驗指標的差異顯著性，圖基檢驗（HSDtest）用于單因素方差分析后的多重比較，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 不同密度大型溞對水體透明度、浮游植物的影響

試驗期間，不同密度大型溞對水體透明度的影響見圖1。結果顯示，試驗2 d 時，各處理透明度差異較?。?～20 d 時，各試驗處理水體透明度表現(xiàn)為CK0.05），說明大型溞的投加密度對水體透明度影響差異不顯著。

圖1 不同密度大型溞對水體透明度的影響

試驗期間，各處理中的浮游植物密度、藍藻門密度、chla 濃度和微囊藻毒素含量的變化趨勢見圖2。結果顯示，在試驗 5～20 d 后，處理 A、B 中的浮游植物密度、藍藻門密度、chla 濃度均顯著低于CK（P<0.05）；在 10 d 時，處理 A 中的這 3 項指標均顯著低于處理B（P<0.05）；隨著時間推移，3 項指標在處理A、B 之間的差異縮小，試驗結束（20 d）時，處理 A 中的3 項指標分別為 3.24×107cells/L、3.10×107cells/L 和42.51 μg/L，處理 B 中的 3 項指標分別為 3.81×107cells/L、3.67×107cells/L 和 54.92 μg/L，均較 15 d 時的數(shù)據(jù)有所反升，此時處理A、B 間無顯著差異（P>0.05）。微囊藻毒素含量在CK 中呈先升高后降低的趨勢，在處理A、B 中則呈先升高后降低再升高的趨勢。試驗5～15 d 時，處理B 中的微囊藻毒素含量顯著低于CK（P<0.05），但隨時間推移，處理B 中的微囊藻毒素含量逐漸上升，試驗結束（20 d）時，處理B中的微囊藻毒素含量升至5.56 μg/L，CK 中的含量為6.27 μg/L，此時處理 B 與 CK 無顯著差異（P>0.05）；試驗15～20 d 時，處理A 中的微囊藻毒素含量雖出現(xiàn)反升，但一直顯著低于CK（P<0.05）。

2.2 2 種沉水植物對水體透明度、浮游植物的影響

試驗期間，2 種沉水植物對水體透明度的影響見圖3。處理C、D 的透明度均高于CK，但除了試驗20 d 時，處理C 的水體透明度顯著高于CK 以外（P<0.05），其余時間點差異均不顯著（P>0.05）。研究表明，沉水植物可以通過抑制浮游植物生長，提高水中透明度，但沉水植物的生長一般需要較長的時間［20］，本試驗周期較短，因而2 種沉水植物對透明度的提升作用并不顯著。

圖2 不同密度大型溞對浮游植物的影響

圖3 2 種沉水植物對水體透明度的影響

浮游植物密度、藍藻門密度、chla 濃度在各處理中的變化趨同（圖4），在試驗5 d 后，處理C、D 中上述指標均顯著低于 CK 中的含量（P<0.05），5 d 時，處理C、D 之間浮游植物密度差異不明顯，5 d 之后處理C 中浮游植物密度、藍藻門密度、chla 濃度顯著低于處理D 和CK（P<0.05）。試驗結束（20 d）時，處理C、D 和CK 中浮游植物密度、藍藻門密度、chla濃度分別表現(xiàn)為 C（3.93×107cells/L）

微囊藻毒素含量在處理C、D 和CK 中的含量均呈先增高后下降的趨勢。試驗2～5 d 時各處理微囊藻毒素含量差異不顯著（P>0.05），5 d 之后，微囊藻毒素在處理C 中的含量顯著低于處理D 和CK（P<0.05），處理 D 中的含量則與 CK 無顯著差異（P>0.05）。試驗結束（20 d）時，微囊藻毒素在處理C、D和CK 中的平均含量由小到大依次為 C（3.88 μg/L）、D（5.55 μg/L）、CK（6.27 μg/L）。這說明狐尾藻能顯著抑制微囊藻毒素含量的上升，而金魚藻對其無顯著抑制作用。

2.3 草-溞聯(lián)合對水體透明度、浮游植物的影響

試驗期間，草-溞聯(lián)合對水體透明度的影響見圖5。試驗2 d 時，各處理水體的透明度差異均不顯著（P>0.05）。試驗 5～20 d 時，各草-溞聯(lián)合處理水體的透明度處理E 最高，且4 個草-溞聯(lián)合處理均高于CK。這是由于金魚藻、狐尾藻對浮游植物有抑制作用，大型溞對浮游植物有攝食作用，在二者的協(xié)同作用下，使水體透明度顯著提升。

浮游植物密度、藍藻門密度、chla 濃度在各草-溞聯(lián)合處理中的變化趨同，見圖6。試驗2 d 時，3項指標在各處理中差異不顯著（P>0.05）。在試驗5～20 d，各處理的浮游植物密度、藍藻門密度、chla 濃度均顯著低于CK（P<0.05）。各處理中3 項指標均呈先升高后降低的趨勢，試驗結束（20 d）時，各草-溞聯(lián)合處理中浮游植物密度、藍藻門密度、chla 濃度分別為 E（0.92×107cells/L）

圖4 2 種沉水植物對浮游植物的影響

圖5 草-溞聯(lián)合對水體透明度的影響

試驗期間，各草-溞聯(lián)合處理和CK 中的微囊藻毒素含量變化趨同，均呈先升高后下降的趨勢。在試驗2～5 d 時，各處理中微囊藻毒素含量差異不顯著（P>0.05）。隨著時間的推移，在試驗10 d 時，各處理中微囊藻毒素含量均顯著低于CK（P<0.05），且處理E 中的微囊藻毒素含量顯著低于其他處理（P<0.05）。15～20 d 時，處理 E、F、G 中的微囊藻毒素含量顯著低于處理H（P<0.05）。試驗結束（20 d）時，各草-溞聯(lián)合處理微囊藻毒素含量表現(xiàn)為E（0.78 μg/L）

分別對比處理E 和G、處理F 和H，可以發(fā)現(xiàn)狐尾藻與大型溞聯(lián)合對浮游植物相關指標的抑制作用均優(yōu)于金魚藻。在單一沉水植物試驗（處理C、D）結果中，發(fā)現(xiàn)狐尾藻對浮游植物的抑制效果優(yōu)于金魚藻，這在草-溞聯(lián)合修復的試驗結果中也得到了進一步的印證，說明在草-溞聯(lián)合修復時，植物的類別會影響其對浮游植物的抑制作用。在之前的結果中，單一使用金魚藻對微囊藻毒素幾乎沒有抑制作用，但將其與大型溞聯(lián)合使用時，微囊藻毒素均被顯著抑制；對比單一使用狐尾藻的試驗結果，發(fā)現(xiàn)大型溞與其聯(lián)合處理對浮游植物的抑制效果也得到進一步提升。這一結果與姜小玉等［21］的研究一致，當沉水植物與大型溞聯(lián)合修復水體時，對浮游植物的抑制效果均優(yōu)于單一使用沉水植物。這是由于大型溞的攝食作用可以迅速提升水體的透明度，使水體恢復成清水態(tài)，改善光照條件，加速沉水植物的生長。試驗結束后，處理E、F 中狐尾藻的平均濕重為（4.23±0.37）g/L；處理G、H 中金魚藻的平均濕重為（3.54±0.62）g/L，均較之前單一使用時有所增加，這也證實了大型溞對沉水植物的生長促進作用。

3 討論

大型溞屬于植食性甲殼類動物，可以大量攝食水中浮游植物，從而降低水中浮游植物的含量；另一方面，其排泄作用加速營養(yǎng)鹽的循環(huán)，促進浮游植物的生長［22］。在試驗初期（2～5 d），高密度處理攝食量大，因而對浮游植物抑制作用較強，但在試驗5～20 d時，高密度處理的排泄作用更大，加速了營養(yǎng)鹽的循環(huán)作用，浮游植物相關指標較低密度處理略高。試驗后期（15～20 d），大型溞排泄作用高于攝食作用，致使20 d 時處理A、B 中的浮游植物密度較15 d 反升。微囊藻毒素作為藍藻的代謝產(chǎn)物，其含量與水體中的藍藻門密度有關，試驗后期，高、低密度處理的微囊藻毒素含量隨藍藻門密度的升高而升高。研究表明，微囊藻毒素一般可以在水生動物體內(nèi)累積［23］，但大型溞機體較小，耐性較差。此外，藍藻毒素會對大型溞的生長和繁殖產(chǎn)生負面影響，且毒性的強弱與藻細胞密度呈正相關［24］，本試驗藍藻門密度較高（>107cells/L），因而對大型溞的負面影響較大，試驗期間處理A、B 水體中均觀察到死亡現(xiàn)象。試驗結束（20 d）時，處理A、B 的大型溞密度分別為（12.7±5.5）ind/L 和（41.8±13.7）ind/L，較添加密度25 ind/L 和100 ind/L 均發(fā)生大幅度下降，且高密度處理因受到較大種群競爭作用影響，下降更為明顯。大型溞死亡時，體內(nèi)儲存的微囊藻毒素會再次被釋放到水體中，因而試驗后期大型溞對微囊藻毒素的抑制作用減弱，致使其含量升高。

沉水植物可以通過吸收水中營養(yǎng)鹽來抑制浮游植物的生長，狐尾藻和金魚藻均可顯著降低水中營養(yǎng)鹽含量，因此二者對于浮游植物也有一定的抑制作用，狐尾藻組的營養(yǎng)鹽下降較金魚藻更為明顯，這也是其對浮游植物的抑制作用更強的原因之一。除了吸收營養(yǎng)鹽以外，沉水植物還可通過競爭光照、生存空間、釋放化感物質(zhì)等方式抑制浮游植物的生長［25］，試驗結束時狐尾藻長勢較好，因此其對浮游植物的抑制作用更強。在本試驗結果中，金魚藻對微囊藻毒素無顯著抑制作用，說明金魚藻對微囊藻毒素的富集能力較差。一方面，金魚藻在試驗過程中對浮游植物以及藍藻門密度抑制能力較狐尾藻弱，另一方面，藍藻細胞破碎、死亡時也會釋放大量的微囊藻毒素［26］。張之浩［27］的研究表明，金魚藻可以釋放α-甲基苯乙醇、己二酸二酯等化感物質(zhì)，此類化感物質(zhì)會破壞藻細胞膜使之破碎，破碎的藻細胞繼續(xù)釋放微囊藻毒素，但本試驗中金魚藻生長較慢，對微囊藻毒素富集能力差，這可能是金魚藻在抑制藍藻門密度的同時卻對微囊藻毒素的抑制作用較差的原因。

草-溞聯(lián)合均能夠顯著抑制水中浮游植物密度、藍藻門密度、chla 濃度和微囊藻毒素含量的上升，其中以低密度大型溞+狐尾藻組合較優(yōu)，試驗結束時相比于對照，可分別降低91.58%、92.05%、91.82%、87.56%。低密度大型溞與沉水植物的聯(lián)合對浮游植物的抑制作用均優(yōu)于高密度大型溞與沉水植物的聯(lián)合，這與單一使用大型溞的試驗結果一致。試驗結束后，處理E、G 的大型溞平均密度分別為（56.3±18.2）ind/L 和（38.3±7.9）ind/L，均較投加密度（25 ind/L）有所增加。分析其原因認為沉水植物可以為大型溞提供庇護空間，減輕其種間競爭作用，有利于其生長和繁殖，進而提升其對浮游植物的攝食作用。此外，低密度大型溞種間競爭較弱，為多營孤雌生殖，這種狀態(tài)的大型溞繁殖速度快、攝食率高，因而對浮游植物的抑制作用更強。相反，試驗結束后，處理F、H 中大型溞的平均密度分別為（63.5±21.7）ind/L和（53.8±27.5）ind/L，均較投加密度（100 ind/L）有所下降。這是由于大型溞密度過高時種間競爭作用過大，大型溞進入兩性繁殖狀態(tài)，試驗期間在處理E、F水體中均觀察到大量帶有冬卵的大型溞個體，這種狀態(tài)的大型溞攝食率極低，對浮游植物的抑制作用被削弱，此外高密度大型溞排泄作用高，加速N、P 營養(yǎng)鹽的循環(huán)作用，促進了浮游植物的生長。因而在草-溞聯(lián)合修復時，低密度大型溞+沉水植物的抑制作用更優(yōu)。結合單一修復中的數(shù)據(jù)進行分析，試驗結束時，在相同溞密度和植物類型的條件下，聯(lián)合修復相比單一使用溞或植物對浮游植物的抑制效果更優(yōu)，在此也可與透明度的變化趨勢相印證。

4 結論

近年來，水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日趨嚴重，已成為亟需解決的環(huán)境問題之一。本研究基于生物操縱理論和水生植物修復理論，結合目標水體現(xiàn)狀，采用大型溞作為濾食性動物的代表，狐尾藻和金魚藻作為沉水植物的代表，在實驗室可控條件下，模擬春夏水華易發(fā)生時期的光照和溫度條件，考察單一生物及其組合對富營養(yǎng)化水體的修復效果，為生物操縱和水生植物修復富營養(yǎng)化水體的應用提供數(shù)據(jù)支持。本研究結論如下。

1）大型溞對浮游植物密度、藍藻門密度、chla 濃度及微囊藻毒素抑制顯著，且低密度（25 ind/L）抑制作用更強。試驗后期（15～20 d）抑制作用減弱，試驗結束（20 d）時，高密度（100 ind/L）下微囊藻毒素含量與對照無顯著差異。

2）狐尾藻和金魚藻均能抑制浮游植物密度、藍藻門密度和chla 濃度的上升，且狐尾藻抑制效果更優(yōu)，而金魚藻對微囊藻毒素含量無顯著抑制作用。

3）試驗結束時，在相同溞密度和植物種類條件下，草-溞聯(lián)合較單一大型溞和單一植物抑制效果更強，且以低密度大型溞（25 ind/L）+狐尾藻最優(yōu)，草-溞聯(lián)合相比單一溞處理，可有效改善其在處理中產(chǎn)生的微囊藻毒素后期反升現(xiàn)象。