茍文博，楊中鐸，周格格

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730050）

單胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）是一種存在于線粒體外膜的氧化還原酶，通過催化內(nèi)源性和外源性單胺類物質(zhì)的代謝，使其失去生理活性，從而控制機體內(nèi)胺類物質(zhì)的水平，其抑制劑在臨床上可用于抑郁癥、帕金森癥、阿爾茨海默癥的治療，但是目前臨床上應用的單胺氧化酶均具有一定的副作用，因此，尋找新型的、副作用小的天然單胺氧化酶是十分必要的［1］。

內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是指在生活史的某段時期生活于植物組織內(nèi)部，對宿主沒有造成明顯病害癥狀的真菌。內(nèi)生真菌在植物中普遍存在，其代謝產(chǎn)物具有結構新穎、活性好的特點，因此備受關注。內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物已顯示出多種生物活性，可用在抗腫瘤、抗病毒、抗菌以及殺蟲等方面，在農(nóng)業(yè)和（或）醫(yī)藥業(yè)中也具有重要的應用潛力。但截至目前，關于內(nèi)生真菌抗單胺氧化酶活性篩選的研究報道還不多見。為了得到天然的單胺氧化酶抑制劑，本試驗對4 種植物內(nèi)生真菌及其抗單胺氧化酶活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 所用藥材有栓翅衛(wèi)矛（Euonymus phel?lomanus）、甘西鼠尾草（Salvia przewalskii）、刺五加（Acanthopanax senticosus）、黃 海 棠（Hypericum as?cyron）4 種新鮮藥用植物，采自甘肅省臨洮縣，由蘭州理工大學楊林副教授鑒定。

Wistar 大鼠購自蘭州大學實驗動物中心。

1.1.2 真菌培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：新鮮馬鈴薯去皮200 g/L，葡萄糖25 g/L，去離子水1 L。固體培養(yǎng)基加 2% 瓊脂，培養(yǎng)基中加入150 μg/mL 青霉素鉀和120 μg/mL 硫酸鏈霉素用以防止細菌污染。

1.1.3 試劑與儀器 瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）、葡萄糖（上海恒生化工有限公司）、乙醇（山東利爾康消毒科技有限公司）、HgCl（2北京化工廠）、注射用青霉素（華北制藥集團）、注射用硫酸鏈霉素（華北制藥集團）、電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）、潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）、數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司）、光學顯微鏡（Classica）。

1.2 待測樣品制備

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離和純化 取出要分離菌株的藥材剪成小段，然后用無菌水將其洗干凈，采用組織切塊法處理表面消毒好的藥材，放入培養(yǎng)基中進行組織培養(yǎng)。選出切口處新長出的菌絲于PDA 培養(yǎng)基上進行反復的劃線分離、純化，最后在斜面上保存。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的制備 取菌絲接種于裝有400 mL PDA 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。發(fā)酵液采用乙酸乙酯萃取，濃縮至干，獲得提取物浸膏。

1.3 單胺氧化酶活性測定

單胺氧化酶活性的測定參照文獻［2］，即采用酶標法測定酶活性。對于提取物，稱取2 mg，用50 μL的無水乙醇溶解，pH 7.6 的磷酸緩沖液稀釋，得濃度為1 mg/mL 的待測樣品，備用。對于單體化合物，配制成300 μg/mL 的待測樣品備用。根據(jù)下式計算抑制率：抑制率=［（空白組-空白本底）-（樣品-樣品本底）］/（空白組-空白本底）×100%。所用樣品做3 次平行測定，取其平均值，用磷酸異丙煙肼作陽性對照。

1.4 內(nèi)生真菌的鑒定

首先采用形態(tài)學方法進行初步鑒定，觀察菌株的菌落顏色、質(zhì)地、氣生菌絲生長情況、基質(zhì)的顏色以及在光學顯微鏡下菌落產(chǎn)孢結構、分生孢子梗著生情況、孢子的形態(tài)與顏色，參照《真菌鑒定手冊》進行初步鑒定。然后用分子生物學的方法對真菌進行序列測定，其中菌株DNA 的提取、ITS 序列的PCR擴增、純化和測序工作由上海生物工程股份有限公司完成。將所得的ITS 序列與GenBank 中已知菌株的DNA 序列比對，確定真菌菌屬。

1.5 化學成分初步分離

將活化好的菌株SJ-2 在50 L 的發(fā)酵罐中用40 L PDB 液體培養(yǎng)基進行大批量發(fā)酵，室溫下連續(xù)培養(yǎng)20 d。培養(yǎng)結束后，菌液用等體積乙酸乙酯萃取2 次，合并萃取液，濃縮至干，得提取物浸膏15.2 g。浸膏用大孔樹脂柱層析，10%、30%、50%、70%、90%乙醇-水體系進行梯度洗脫，通過TLC 色譜法檢查合并樣品，最終得到了5 個粗組分SJ-2-A、SJ-2SB、SJ-2-C、SJ-2-D、SJ-2-E。

SJ-2-D 組分（3.58 g）干法上樣硅膠柱層析分離，用氯仿-甲醇體系（120∶1～10∶1）進行梯度洗脫，通過TLC 色譜法檢查合并樣品。得到9 個組分（SJ-2-D-1 至 SJ-2-D-9）。

SJ-2-D-2 組分（850 mg）干法上樣硅膠柱層析分離，石油醚-丙酮體系（80∶1～20∶1）梯度洗脫，通過TLC 色譜法檢查合并樣品，得到7 個組分（SJ-2-D-2-A 至 SJ-2-D-2-G）。其中，組分 SJ-2-D-2-C（180 mg）干法上樣硅膠柱層析分離，石油醚-丙酮體系（60∶1～20∶1）梯度洗脫，通過 TLC 色譜法檢查合并樣品，得到化合物 1（10 mg）。

SJ-2-D-3 組分（240 mg），用 4 mL 色譜甲醇溶解，HPLC 分離，77% 甲醇-水為流動相，流速為1.0 mL/min，得到化合物 2（tR=40.39 min，10 mg）。

SJ-2-D-4 組分（280 mg），用 4 mL 色譜甲醇溶解，HPLC 分離，58% 甲醇-水為流動相，流速為1.0 mL/min，得到化合物 3（tR=40.23 min，18 mg）。

2 結果與分析

2.1 不同藥用植物組織中內(nèi)生真菌數(shù)量

經(jīng)過分離純化后得到20 株內(nèi)生真菌，其中從黃海棠中得到10 株內(nèi)生真菌，從刺五加中得到2 株內(nèi)生真菌，從甘西鼠尾草中得到6 株內(nèi)生真菌，從栓翅衛(wèi)矛中得到2 株內(nèi)生真菌，表明藥用植物組織中存在豐富的內(nèi)生真菌資源。

2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵物的單胺氧化酶抑制活性

通過酶標法測定了所有內(nèi)生真菌提取物對單胺氧化酶的抑制活性，活性較高的3 種內(nèi)生真菌提取物為栓翅衛(wèi)矛（SJ-2）、刺五加（WJ-3）、黃海棠（HJ-1）的PDB 液體培養(yǎng)基菌液提取物（表1）。對抑制率 70% 以上的提取物測定了其IC50，SJ-2、WJ-3、HJ-1 發(fā) 酵 提 取 物 的IC50分 別 為 126.64、118.56、221.34 μg/mL。

表1 內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物提取物的抗單胺氧化酶活性

2.3 菌株的分子生物學鑒定

菌株SJ-2 氣生菌絲棉絮狀、茂盛、白色，菌落背面產(chǎn)生淡紅色色素，其ITS 序列與 GenBank 中的MK028863.1（Fusarium tricinctum）比 對 相似 度 為98%，因此將內(nèi)生真菌SJ-2 鑒定為鐮孢屬（Fusarium）真菌。菌株WJ-3 菌絲有橫隔，分生孢子經(jīng)多次分生產(chǎn)生幾輪對稱或不對稱小梗，其ITS 序列與Gen?Bank 中的 MK357511.1（Penicilliumsp.）比對相似度為97%，因此將內(nèi)生真菌WJ-3 鑒定為青霉菌屬（Penicillium）真菌。菌株HJ-1 生長速度較快，菌落為白色、毯狀、全緣，基質(zhì)棕色，將菌株HJ-1 的ITS序列與 GenBank 中的 MH329584.1（Alternaria alter?nata）比對，相似度為98%，因此將內(nèi)生真菌HJ-1鑒定為鏈格孢屬（Alternaria）真菌。

2.4 單體化合物結構鑒定

通過硅膠柱色譜、高效液相色譜等方法從菌株SJ-2 的菌液提取物中分離得到了3 個純的單體化合物，并通過1H NMR、13C NMR 等波譜解析技術，參考文獻［3-5］，鑒定了其結構。

2.4.1 化合物1 白色粉末，紫外光波長254 nm 下有吸收，硫酸-乙醇不顯色。1H NMR（600 MHz，CD3OD）：δ5.14（3H，d，J=7.9 Hz），4.52（3H，d，J=9.4 Hz），3.12（9H，s），2.37～2.26（6H，m），1.06（9H，d，J=6.6 Hz），0.98（9H，d，J= 6.7 Hz），0.96（9H，d，J=6.8 Hz），0.90（9H，d，J=6.7 Hz）。13C NMR（50 MHz，CDCl3）：18.4（CH3），18.6（CH3），19.3（CH3），20.3（CH3），27.8（CH），29.8（CH），33.0（NCH3），62.9（CH），75.7（CH），169.3（C=O），170.2（C=O）。其1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)與參考文獻［4］報道基本一致，因此該化合物被鑒定為Ennia?tin B。

2.4.2 化合物2 白色粉末，紫外光波長254 nm 下有吸收，硫酸-乙醇顯黃色。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ6.61（1H，d，J=2.2Hz，H-4），7.02（1H，d，J=2.2Hz，H-6），3.69（6H，s，7-OCH3和 H-8），6.45（1H，s，H-3’），6.06（1H，s，H-5），2.29（3H，s，H-7），3.37（3H，s，H-9），12.99（1H，s，2-OH）。其1H-NMR 數(shù)據(jù)與參考文獻［5］報道一致，因此該化合物被鑒定為Monomethylsulochrin。

2.4.3 化合物3 白色粉末，紫外光波長254 nm 下有吸收，硫酸-乙醇顯黃色。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ7.70（1H，brs，H-1），7.42（1H，d，J=8.2 Hz，H-16），6.85（1H，d，J=2.3 H z，H-19），6.80（1H，dd，J=8.2，2.3 Hz，H-17），5.97（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），4.90（1H，d，J=9.5 Hz，H-21），4.17（1H，dd，J=11.0 Hz，5.0 Hz，H-12），4.10（1H，dd，J=9.5、7.5 Hz，H-6），3.82（3H，s，H-25）3.64（2H，m，H-9），3.50（1H，dd，J=15.8、5.0 Hz，H-13a），3.09（1H，dd，J=15.8、11.0 Hz，H-13b），2.40（1H，m，H-7a），2.22（1H，m，H-7b），2.05（1H，m，H-8a），1.92（1H，m，H-8b），1.99（3H，s，H-24），1.64（3H，s，H-23）。其1H-NMR 數(shù)據(jù)與參考文獻［6］報道一致，因此該化合物被鑒定為Fumitremorgin C。

3 討論

在試驗中分離內(nèi)生菌所用的植物都是新鮮植物，試驗前用純凈水清洗 4～5 次，然后用75% 乙醇和1% 的升汞表面消毒，最后用無菌水洗滌，洗滌后的無菌水進行涂板培養(yǎng)，結果無雜菌長出，證明消毒比較徹底［6］。

目前，人們對植物內(nèi)生真菌活性的研究主要集中在抗菌、抗腫瘤方面。如李冬利等［7］在藥用植物白木香（Aquilaria sineusis）中分離得到19 株內(nèi)生真菌，用MTT 法測定它們的提取物對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SF-268 的細胞毒活性，結果表明，其中抑制率90% 以上的菌株有 6 株。Jouda 等［8］在藤黃（Garcin?ia nobilis）的葉中分離得到一株青霉屬真菌，它的次級代謝產(chǎn)物對枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強的抑制活性。但截至目前，關于內(nèi)生真菌提取物的抗MAO 活性的報道較少。本試驗對分離自4 種藥用植物的20 株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物的抗單胺氧化酶活性進行了研究，篩選出3 種具有活性的菌株。通過分子生物學方法鑒定它們?yōu)殓犳邔?、青霉菌屬和鏈格孢屬真菌。鐮孢屬為絲孢綱瘤座菌目真菌，該屬真菌具有抗菌等活性［9］。青霉菌屬為子囊菌亞門不整囊菌綱散囊菌目散囊菌科真菌，該屬真菌能代謝出多種抗腫瘤、抗菌等活性的化合物［10］。鏈格孢屬是全球分布最廣的半知菌類真菌之一，是一種有應用潛力的生物資源，該屬真菌能代謝出具有抗腫瘤、抗菌活性的化合物［11，12］。截至目前，未見關于上述3 屬真菌抗單胺氧化酶活性的報道。本試驗進一步對篩選出的活性菌株 SJ-2（Fusarium tricinctum）的化學成分進行了初探，得到了3 個化合物，分別為 Enniatin B（化合物 1）、Monomethylsulo?chrin（化合物 2）、Fumitremorgin C（化合物 3）。據(jù)報道，Enniatin B 為一種細胞毒素，能夠誘導細胞凋亡，還能夠增加脂多糖（LPS）引發(fā)的細胞中白細胞介素-1β（IL-1β）的釋放［13］。張弘弛等［14］發(fā)現(xiàn) Mono?methylsulochrin 具有抑制擬青霉屬（Penicilliopsis）、粉孢霉屬（Oidium）、曲霉屬（Aspergillus）、絲核菌屬（Rhizoctonia）等真菌的作用。Fumitremorgin C 是一種霉菌毒素，還是乳腺癌抗性蛋白（ABCG2/BCRP）的抑制劑，可逆轉(zhuǎn)與癌細胞相關的細胞耐藥性［15］。