米琛，蔣榮偉，任莉，師文，羅玉梅

食管癌是全世界第六大常見的癌癥死亡原因，作為發(fā)病率及病死率較高的消化系統(tǒng)腫瘤，食管癌的治療與預(yù)后是全球醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)的一個(gè)重大的健康挑戰(zhàn)[1]。食管癌因其早期診斷率低、耐藥性強(qiáng)及復(fù)發(fā)率高等原因使其具有高死亡率，食管癌患者的生存率較低[2]。到目前為止，該疾病早期仍以手術(shù)治療為主要治療方案，晚期患者多采用綜合治療的方式以緩解患者痛苦，提高生命質(zhì)量[3]。雖然手術(shù)切除和明確的化療作為一種單一的治療方式最初是有效的，但是順鉑和5-氟尿嘧啶(5-Fu)聯(lián)合化療會(huì)導(dǎo)致長期生存率低，且復(fù)發(fā)率和耐藥率較高[4]。所以，致力于尋找食管癌治療的新靶點(diǎn)至關(guān)重要。

近年來，腫瘤與免疫學(xué)治療的關(guān)系受到極大的關(guān)注[5]。與手術(shù)和放化療等方法不同，免疫治療通過恢復(fù)T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別及殺傷作用治療癌癥[6]。其中，程序性死亡蛋白-1(programmed death-1，PD-1)/程序性死亡蛋白配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)抑制劑是研究較為成熟且應(yīng)用較廣的免疫抑制劑，PD-1/PD-L1免疫治療也成為人類惡性腫瘤治療歷史上的一次飛躍。帕博利珠單抗作為人源化的免疫球蛋白G4單克隆PD-1抗體，能夠通過抑制PD-1與PD-L1結(jié)合使細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞[7]。食管癌的多中心Ⅰ期研究表明，帕博利珠單抗對(duì)PD-L1陽性的晚期食管癌患者具有良好的初步抗腫瘤活性和可控制的毒性，PD-L1陽性與PD-L1陰性食管癌患者的疾病客觀緩解率分別為13.8%和6.3%[8]。還有研究表明，腫瘤微環(huán)境中高PD-L1表達(dá)可使免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷能力減弱，這也是應(yīng)用PD-1/PD-L1抑制劑的基礎(chǔ)[9]。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南也推薦對(duì)局部晚期、復(fù)發(fā)性或存在轉(zhuǎn)移的食管腺癌進(jìn)行PD-L1檢測，PD-L1高表達(dá)的患者可選擇使用PD-1/PD-L1抑制劑[10]。因此，篩選食管癌免疫治療的獲益人群是提高其治療和改善預(yù)后的有效方法之一。腫瘤中發(fā)生浸潤的免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其浸潤模式與臨床結(jié)果存在一定相關(guān)性，并可能成為藥物靶標(biāo)來提高生存率，因此，分析食管癌浸潤性免疫細(xì)胞的組成特點(diǎn)，以及浸潤模式與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性，有利于臨床篩選食管癌免疫治療的獲益人群。鑒于此，本研究應(yīng)用 Cibersort 軟件對(duì)公共數(shù)據(jù)庫癌癥基因組圖譜(TCGA數(shù)據(jù)庫)中食管癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步提高食管癌的生存率奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從公共數(shù)據(jù)庫癌癥基因圖譜(the cancer genome atlas, TCGA, https://cancergenome.nih.gov/)中下載所有食管癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)共 171 例，其中包含食管癌組織160 例、正常食管組織 11 例，并下載 183 例食管癌樣本的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、臨床分期、腫瘤分級(jí)和生存狀態(tài)等。

1.2 數(shù)據(jù)處理方法

1.2.1 計(jì)算食管癌中浸潤性免疫細(xì)胞的組成

安裝Perl軟件并將基因表達(dá)數(shù)據(jù)整理成行名為基因名、列名為樣品名的矩陣，提取獲得食管癌組織和正常組織轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，使用R語言limma包、 BiocManager包將表達(dá)譜矩陣校正，用Cibersort軟件(http://cibersort.stanford.edu/)來計(jì)算每個(gè)腫瘤組織中M1巨噬細(xì)胞、 M2巨噬細(xì)胞、 M0巨噬細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等共22種浸潤性免疫細(xì)胞類型的相對(duì)比例。為進(jìn)一步提高精度，以Cibersort軟件中P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣本篩選，篩選出有意義的樣本后，利用R語言及相應(yīng)包繪制樣本中每種免疫細(xì)胞的柱狀圖(即食管癌及正常樣本中各種免疫細(xì)胞占比)、相關(guān)性熱圖(即食管癌組織樣本中每種免疫細(xì)胞占比的相關(guān)性)和小提琴圖(即可視化免疫細(xì)胞在食管癌及正常組織中的分布)。

1.2.2 評(píng)估食管癌免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性

將上述轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，評(píng)估食管癌免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床特征(年齡、性別、臨床分期、腫瘤分級(jí))及預(yù)后的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R語言(3.6.1版本)和Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于丟失的數(shù)據(jù)，則應(yīng)用列表刪除法進(jìn)行處理，如果缺少任一單個(gè)值，則將該樣本整體排除。以R語言中的corrplot包繪圖進(jìn)行不同免疫細(xì)胞間相關(guān)性的檢測；采用Perl分析食管癌免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床特征的相關(guān)性；再根據(jù)免疫細(xì)胞水平中位值將患者分為高、低浸潤組，應(yīng)用R語言中的survival包，通過Kaplan-Meier Log-rank法計(jì)算其與生存的相關(guān)性，并繪制圖形。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌樣本的臨床病理特征

183例食管癌樣本中，男性患者156例(85.2%)， 女性患者27例(14.8%)；臨床分期為T0者1例(0.5%)，T1者31例(16.9%)， T2者43例(23.5%)， T3者86例(47.0%)， T4者5例(2.8%)，未知17例(9.3%)；M0者134例(73.2%)，M1者9例(4.9%)，MX者18例(9.8%)，未知22例(12.0%)；N0者76例(41.5%)，N1者68例(37.2%)，N2者12例(6.6%)，N3者8例(4.4%)，NX者2例(1.1%)，未知17例(9.3%)；生存狀態(tài)為存活74例(40.4%)，死亡109例(59.6%)。

2.2 食管癌組織浸潤免疫細(xì)胞情況

采用Cibersort評(píng)估了160例食管癌和11例正常組織免疫細(xì)胞的分布情況，利用R語言及相應(yīng)包繪制的柱狀圖、相關(guān)性熱圖和小提琴圖分別如圖1、圖2、圖3所示。圖1和圖3顯示，食管癌腫瘤組織與正常組織相比，M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T細(xì)胞含量較高；漿細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、靜息狀態(tài)的肥大細(xì)胞的含量較低。圖2顯示，在食管癌組織中，構(gòu)成比相關(guān)系數(shù)較大的免疫細(xì)胞包括： 靜息狀態(tài)的CD4+記憶性T細(xì)胞與濾泡輔助性T細(xì)胞(-0.51)，靜息狀態(tài)肥大細(xì)胞與活化的肥大狀細(xì)胞(-0.46)，記憶B細(xì)胞與幼稚B細(xì)胞(0.45)。

圖1 食管癌及正常樣本中各種免疫細(xì)胞占比的柱狀圖

圖2 食管癌組織樣本中每種免疫細(xì)胞占比相關(guān)熱圖

圖3 食管癌及正常組織中免疫細(xì)胞構(gòu)成小提琴圖(藍(lán)色：正常組織；紅色：腫瘤組織)

2.3 食管癌免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床特征的相關(guān)性

2.3.1 與年齡和性別的相關(guān)性 根據(jù)年齡是否>50歲和患者性別進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，各免疫細(xì)胞含量與年齡分級(jí)和性別之間，均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

2.3.2 與臨床分期和腫瘤分級(jí)的相關(guān)性 根據(jù)臨床分期和腫瘤分級(jí)進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示，M0巨噬細(xì)胞的含量與臨床N分期成負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 食管癌免疫細(xì)胞與臨床N期的相關(guān)性

2.4 食管癌免疫細(xì)胞浸潤模式與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)各免疫細(xì)胞構(gòu)成比中位值高低，采用Kaplan-Meier Log-rank法計(jì)算其與生存的相關(guān)性，結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)樹突狀細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞構(gòu)成水平對(duì)患者生存有顯著影響(P<0.05)，其中，靜息狀態(tài)樹突狀細(xì)胞與活化的肥大細(xì)胞細(xì)胞構(gòu)成比高者總生存期短，見圖5。

圖5 免疫細(xì)胞構(gòu)成水平的Kaplan-Meier曲線 A：靜息狀態(tài)樹突細(xì)胞構(gòu)成水平Kaplan-Meier曲線; B：活化的肥大細(xì)胞構(gòu)成水平Kaplan-Meier曲線

3 討論

在較多的科學(xué)研究中多用免疫組化法或流式細(xì)胞術(shù)來分析腫瘤組織免疫細(xì)胞的浸潤模式，具有操作繁瑣，效率低下的弊端，本研究采用的Cibersort軟件由斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員Newman等于2015年發(fā)明，該軟件采用了反卷積算法，可準(zhǔn)確、快速地分析復(fù)雜組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，優(yōu)勢較為突出[11]。本文首先基于 TCGA 數(shù)據(jù)庫中食管癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，對(duì)食管癌浸潤性免疫細(xì)胞的組成特點(diǎn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與正常組織相比，食管癌腫瘤組織中，M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T細(xì)胞含量較高；漿細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、靜息狀態(tài)的肥大細(xì)胞的含量較低，且有三對(duì)免疫細(xì)胞之間的構(gòu)成比相關(guān)系數(shù)較大，說明這些免疫細(xì)胞可能參與了食管癌的發(fā)生與發(fā)展，食管癌組織中免疫細(xì)胞的組成可能存在一定的特異性，可為該病的早期篩查與診斷提供參考。

進(jìn)一步對(duì)食管癌組織中免疫細(xì)胞浸潤模式與臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、漿細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、靜息狀態(tài)的肥大細(xì)胞的含量變化較大。并且本文經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，M0 巨噬細(xì)胞與患者臨床N分期呈負(fù)相關(guān)，這一分析結(jié)果揭示了免疫浸潤細(xì)胞模式能夠檢測或者用于預(yù)測食管癌的臨床分期。與此同時(shí)，本研究對(duì)患者性別與年齡進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，年齡和性別與各種免疫細(xì)胞并無顯著相關(guān)性，綜合以上分析，臨床分期可能是影響食管癌免疫浸潤細(xì)胞浸潤模式的重要因素之一。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，腫瘤分期也不斷發(fā)生變化，同時(shí)也伴隨著免疫細(xì)胞浸潤模式發(fā)生著改變。作為免疫浸潤細(xì)胞之一的巨噬細(xì)胞，根據(jù)其免疫功能的不同可以分為M1和M2巨噬細(xì)胞兩種類型。M1巨噬細(xì)胞是由前體M0巨噬細(xì)胞在干擾素-γ刺激下活化而形成，其主要進(jìn)行各種炎癥反應(yīng)以及對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，能夠顯著地對(duì)抗腫瘤生成；M2型巨噬細(xì)胞是在Th2分泌的細(xì)胞因子如IL-4和IL-13作用下分化形成，有助于組織的修復(fù)，參與了纖維化和體液免疫，同時(shí)還具有激活腫瘤細(xì)胞增殖的作用，能夠促進(jìn)腫瘤的生長[12-13]。本文研究發(fā)現(xiàn)，M0巨噬細(xì)胞與患者臨床N期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這解釋了隨著腫瘤分期進(jìn)程不同，患者體內(nèi)的M0巨噬細(xì)胞的含量發(fā)生變化，M0在干擾素的刺激下形成M1巨噬細(xì)胞，間接影響著M1巨噬細(xì)胞的增殖，從而對(duì)食管癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生作用[14]。

接下來對(duì)食管癌組織中免疫細(xì)胞浸潤模式與預(yù)后的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)樹突狀細(xì)胞與活化的肥大細(xì)胞構(gòu)成比高者總生存期相對(duì)較短，說明這兩種免疫細(xì)胞在食管癌的預(yù)后預(yù)測中具有一定程度的價(jià)值。樹突狀細(xì)胞是功能最為強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，是CD4+T和CD8+T初始細(xì)胞主要的激活細(xì)胞[15]。它能夠?qū)乖M(jìn)行攝取和呈遞，并將其遷移到淋巴器官并對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行激活而發(fā)揮免疫反應(yīng)。這些特點(diǎn)使得樹突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)和維持抗腫瘤免疫方面發(fā)揮著重要的作用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細(xì)胞是Treg細(xì)胞抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)[16]，腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞與腫瘤相關(guān)的CD11c+DCs相互作用，減少了樹突狀細(xì)胞共刺激配體的表達(dá)，進(jìn)而能夠?qū)細(xì)胞的增殖進(jìn)行抑制。此外，清除Treg細(xì)胞能夠恢復(fù)腫瘤相關(guān)的CD11c+DCs免疫原性，活化CD8+T細(xì)胞和表達(dá)共刺激分子，進(jìn)而能夠發(fā)揮抑制腫瘤的生長作用[17-18]。肥大細(xì)胞是一種獨(dú)特的駐留在組織中的免疫炎癥細(xì)胞，它能分泌一系列不同的生物活性化合物，這些化合物可以刺激、調(diào)節(jié)或抑制免疫反應(yīng)。肥大細(xì)胞幾乎遍布于全身器官，尤其在人體消化道中分布廣泛[19-20]。劉柳等[21]將人食管癌EC109細(xì)胞株及其一系列對(duì)比處理移入小鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行觀察完整免疫體系對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌細(xì)胞移入小鼠腹腔，主要誘導(dǎo)T型肥大細(xì)胞參與免疫反應(yīng)。本研究中，樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞構(gòu)成比高者總生存期較長，說明該細(xì)胞可作為食管癌的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。樹突狀細(xì)胞是作為人類免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的特異性抗原呈遞細(xì)胞，可以激活腫瘤免疫治療中的 T 細(xì)胞，發(fā)揮治療作用。但是，目前對(duì)于靜息狀態(tài)的樹突狀細(xì)胞在腫瘤中的研究相對(duì)較少，需要后續(xù)的臨床研究[22]。

綜上所述，通過 Cibersort 軟件對(duì)食管癌浸潤免疫細(xì)胞組成進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可為免疫細(xì)胞與食管癌的相關(guān)性研究提供新的線索與思路：免疫細(xì)胞參與了食管癌的發(fā)生與發(fā)展，且與正常組織相比，食管癌組織中免疫細(xì)胞的組成存在一定的特異性，可為該病的早期篩查與診斷提供參考；腫瘤患者的不同臨床分期可能存在不同的免疫細(xì)胞浸潤模式，臨床可以此為基礎(chǔ)，對(duì)治療藥物的靶標(biāo)進(jìn)行探索，并進(jìn)行有針對(duì)性的治療來提高生存率。