李 達(dá)，苗欣宇，孫慕白，牛紅紅，孫瑞悅，王景會(huì)*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033；2.延邊大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 延吉 133002）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是當(dāng)今社會(huì)生產(chǎn)中廣泛使用的一種微生物，它屬于芽孢桿菌屬中的一種，在自然界環(huán)境土壤、湖泊中分布極其廣泛，生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中大部分菌株不會(huì)產(chǎn)生毒性物質(zhì)，對(duì)人畜等生命幾乎無(wú)任何毒害作用，故廣受人們關(guān)注[1-3]?？莶菅挎邨U菌（B.subtilis）菌體形態(tài)為桿狀，產(chǎn)生孢子，在微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，分泌產(chǎn)生許多抗菌素[4-5]和特定的酶類[6-7]等，其菌體發(fā)酵液抑菌性能較強(qiáng)，對(duì)多種病原菌有抑制作用，本身所產(chǎn)生的芽孢使其對(duì)外界生長(zhǎng)環(huán)境有極強(qiáng)抗逆性能[8]。對(duì)微生物繁殖營(yíng)養(yǎng)條件需求簡(jiǎn)單，分裂生長(zhǎng)速度較快[9]，因而枯草芽孢桿菌（B.subtilis）產(chǎn)品的生產(chǎn)加工工藝簡(jiǎn)單、活菌存活率高。其菌體對(duì)外界環(huán)境高適應(yīng)性[10]及發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用[11-12]，可以采用不同的生產(chǎn)工藝，產(chǎn)品類型靈活多變，使其成為當(dāng)今社會(huì)生產(chǎn)中使用廣泛的微生物菌種之一。

目前，國(guó)內(nèi)外枯草芽孢桿菌（B.subtilis）微生物發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液主要是分離出菌體生產(chǎn)微生物制劑或?qū)ζ渖锨逡哼M(jìn)行提取純化代謝產(chǎn)物進(jìn)而生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品。LI R F等[13]通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）優(yōu)化了生長(zhǎng)重要參數(shù)，使枯草芽孢桿菌DB1342對(duì)白色念珠菌的生長(zhǎng)抑制率比優(yōu)化前提高30.86%。MEENA K R等[14]通過(guò)響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化枯草芽孢桿菌（B.subtilis）KLP2015生產(chǎn)工藝參數(shù)，使其對(duì)霉菌具有抑制作用的脂肽的產(chǎn)量提高1.8倍。KILANI-FEKI O等[15]通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌（B.subtilis）M13培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化篩選后，使抗真菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)量比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高93%以上。沈躍麗等[16]優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件，對(duì)熒光假單孢菌及短小芽孢桿菌抑菌能力分別提高了42%和47%。湯穎秀[17]對(duì)誘變枯草芽孢桿菌產(chǎn)表面活性素工藝進(jìn)行優(yōu)化，比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了1.48倍。任玉文等[18]通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝，使枯草芽孢桿菌菌體產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了3.95倍。孫沙沙等[19]優(yōu)化了培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝，使菌株對(duì)煙草野火病害抑菌圈直徑提高了25.72%。賈田惠等[20]優(yōu)化了發(fā)酵過(guò)程主要因素，使對(duì)真菌抑菌圈直徑提高了72.5%。

本研究通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)1株對(duì)細(xì)菌具有較強(qiáng)拮抗能力枯草芽孢桿菌（B.subtilis）CGMCC5174的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用細(xì)菌活菌量和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并結(jié)合滿意度函數(shù)法，以期利用一個(gè)總體滿意度值來(lái)綜合評(píng)價(jià)發(fā)酵液中細(xì)菌活菌總量和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量，從而更好地預(yù)測(cè)出發(fā)酵工藝優(yōu)化參數(shù)對(duì)發(fā)酵液中活菌和抑菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CGMCC5174：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所；大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC44825：廣東微生物種質(zhì)資源庫(kù)。

1.1.2 化學(xué)試劑

胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、瓊脂（均為生化試劑）、氯化鈉、葡萄糖（均為分析純）：上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板[21]：胰蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂15 g/L，去離子水定容至1 L，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至7.4，121 ℃滅菌15 min。

LB液體培養(yǎng)基[22]：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、葡萄糖3 g/L，去離子水定容至1 L，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至6.4，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

XSP-2C生物顯微鏡：日本Olympus公司；PB-10型酸度計(jì)：德國(guó)賽多利斯公司；MLS-3780高壓滅菌器：日本Sanyo公司；Cary 300 UVVIS分光光度計(jì)：美國(guó)Varian公司；BCN-1360B型無(wú)菌超凈工作臺(tái)、HZQ-Q振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；D3024R 實(shí)驗(yàn)臺(tái)式高速冷凍型離心機(jī)：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱、JWS24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Forma-80 ℃905-ULTS超低溫冰箱：賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)液的制備

枯草芽孢桿菌CGMCC5174種子培養(yǎng)液的制備：菌株甘油凍干管從-80 ℃低溫冰箱中取出，放在37 ℃恒溫水浴中迅速溶解。從凍干管中取出1 mL菌液加入到裝液量為10 mL/250 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，得到種子培養(yǎng)液，放入-4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

枯草芽孢桿菌CGMCC5174培養(yǎng)液的制備：從種子培養(yǎng)液中取出1.5 mL菌液加入裝液量為100 mL/250 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，再重復(fù)上述步驟活化2次，得到菌株CGMCC5174培養(yǎng)液，放入-4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC44825培養(yǎng)液的制備：大腸桿菌甘油凍干管-80 ℃低溫冰箱中取出，37℃恒溫水浴迅速溶解。從凍干管中取出2 mL菌液加入裝液量為10 mL/250 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。再?gòu)呐囵B(yǎng)瓶中取出1 mL菌液加入裝液量為100 mL/250 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，得到菌株CMCC 44825培養(yǎng)液，放入-4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑制致病菌能力檢測(cè)[23]

取枯草芽孢桿菌CGMCC517培養(yǎng)液在8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，將濾紙片（直徑8 mm）浸泡于分離得到的上清液中15 min。取大腸桿菌CMCC44825菌液50 μL，均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，靜置20 min，放上準(zhǔn)備好的濾紙片，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h，觀察抑菌情況。用游標(biāo)卡尺測(cè)抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑大小表示抑菌活性（抑菌圈直徑＞8 mm，判為有抑菌作用；抑菌圈直徑＜8 mm，判為無(wú)抑菌作用）。

1.3.3 枯草芽孢桿菌活菌數(shù)的測(cè)定[24]

采用平板稀釋計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌活菌數(shù)，對(duì)操作方法稍作改動(dòng)。使用無(wú)菌移液槍取出1 mL充分搖勻的枯草芽孢桿菌CGMCC517發(fā)酵液，沿試管壁緩慢注入裝有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，放到振蕩器充分混合均勻。按著上一步驟，依次制備10倍稀釋的發(fā)酵液樣品，共稀釋8個(gè)試管，分別標(biāo)注1～8號(hào)。分別從4、7、8號(hào)管中吸取100 μL置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，均勻涂布，放入培養(yǎng)箱37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h，取出后點(diǎn)數(shù)平板上單菌落數(shù)目，計(jì)算枯草芽孢桿菌活菌數(shù)。

1.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

按1.3.1中枯草芽孢桿菌試驗(yàn)培養(yǎng)液的培養(yǎng)工藝，分別設(shè)置初始pH值為（5.4、6.4、7.4、8.4、9.4），裝液量（25 mL/250 mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL），接種量為（0.5 mL/100 mL、1.5 mL/100 mL、3.5 mL/100 mL、5.5 mL/100 mL、7.5 mL/100 mL），培養(yǎng)溫度（32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃、52 ℃），轉(zhuǎn)速（100 r/min、150 r/min、200 r/min、250 r/min、300 r/min），培養(yǎng)時(shí)間（8 h、14 h、20 h、26 h、32 h），考察初始pH值、裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌活菌量及抑菌圈直徑的影響。

1.3.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

（1）Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以枯草芽孢桿菌活菌量及抑菌圈直徑為響應(yīng)值，選取6個(gè)因素初始pH值（A）、轉(zhuǎn)速（B）、培養(yǎng)溫度（C）、裝液量（D）、接種量（E）、培養(yǎng)時(shí)間（F）進(jìn)行Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)[14]。對(duì)6個(gè)因素的最優(yōu)培養(yǎng)條件范圍分別取高、低兩個(gè)水平，PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design for fermentation process optimization

（2）Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)上述Plackett-Burman（BB）試驗(yàn)結(jié)果，選擇出對(duì)結(jié)果顯著性影響因素?fù)u瓶轉(zhuǎn)速（X1）、裝液量（X2）與培養(yǎng)時(shí)間（X3）進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)優(yōu)化，BB試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design for fermentation process optimization

1.3.6 滿意度函數(shù)-響應(yīng)面設(shè)計(jì)[25]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)，選擇分析結(jié)果較為顯著的因素，以活菌量（Y1）和抑菌圈直徑（Y2）為響應(yīng)值，為找到合理的優(yōu)化條件，采用滿意度函數(shù)法將兩種響應(yīng)值進(jìn)行綜合分析，進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化。采用一種高可取性的總體滿意度值統(tǒng)計(jì)分析法見(jiàn)式（1）：

式中：S為總體滿意度值；in為第n個(gè)數(shù)據(jù)響應(yīng)值的權(quán)；An為第n個(gè)數(shù)據(jù)響應(yīng)的滿意度值，An定義見(jiàn)式（2）：

式中：Yn（X）為第n個(gè)響應(yīng)值，Ln為第n個(gè)響應(yīng)值的規(guī)定下限，Yn，max（X）為第n個(gè)響應(yīng)值所不能超過(guò)的最大上限。

在整個(gè)試驗(yàn)中，發(fā)酵液中活菌量對(duì)數(shù)值均＞6.0，抑菌圈直徑＞20 mm，因此在滿意度函數(shù)計(jì)算中，分別規(guī)定發(fā)酵液中活菌量對(duì)數(shù)值下限為6.0，抑菌圈直徑下限為20 mm，活菌量對(duì)數(shù)值不可能超過(guò)最大上限9.0，抑菌圈直徑不可能超過(guò)最大上限30 mm，即可定義滿意度函數(shù)為式（3）和（4）。

式中：A1和A2分別為發(fā)酵液中活菌量和抑菌圈徑的滿意度。取每個(gè)滿意度函數(shù)的權(quán)為1，總體滿意值為S（%）=100%。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Sigmaplot 14.0、SPSS 21.0對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和數(shù)據(jù)處理，Minitab 19.0進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)和滿意度函數(shù)分析法-響應(yīng)面分析數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始pH值的影響

培養(yǎng)基中微生物生長(zhǎng)繁殖和菌體代謝產(chǎn)物生物合成都有其最適合和能夠耐受的外界環(huán)境pH范圍[26]。初始pH值會(huì)影響到培養(yǎng)基中菌體細(xì)胞膜上的電荷狀態(tài)，引起細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生不可逆性改變，進(jìn)而對(duì)培養(yǎng)細(xì)菌的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和特定代謝產(chǎn)物能力產(chǎn)生影響，并對(duì)發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性同樣有影響[27]。初始pH值對(duì)發(fā)酵液中活菌量及抑菌能力影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 初始pH值對(duì)菌株CGMCC5174發(fā)酵性能的影響Fig.1 Effect of initial pH on fermentation performance of strain CGMCC5174

由圖1可知，菌株CGMCC5174初始活菌量對(duì)數(shù)值為4.27，在初始pH值5.4～9.4范圍內(nèi)，菌株都有不同程度的增長(zhǎng)，但在初始pH值5.4、9.4生長(zhǎng)情況不理想，與其他條件差異性顯著（P＜0.05）。在范圍7.4～8.4范圍內(nèi)，菌株抑菌圈直徑之間差異性不顯著（P＞0.05）。初始pH值7.4時(shí)菌液活菌量對(duì)數(shù)值為7.2±0.04及抑菌圈直徑為（21.0±1.8）mm，顯著高于其他條件抑菌圈直徑（P＜0.05），這是因?yàn)槌跏紁H值為7.4時(shí)培養(yǎng)環(huán)境促進(jìn)了枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)吸收，促進(jìn)了菌株的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而分泌出大量的抗菌代謝產(chǎn)物；但初始pH值＜7.4或＞7.4時(shí)都會(huì)影響菌株的生理狀態(tài)，降低其生長(zhǎng)繁殖速度，大大降低其分泌代謝產(chǎn)物的能力。因此，選擇最適初始pH值為7.4。

2.1.2 搖瓶轉(zhuǎn)速的影響

枯草芽孢桿菌屬于好氧微生物，搖瓶培養(yǎng)可方便地控制通氣量，操作簡(jiǎn)單，微生物細(xì)胞生長(zhǎng)較好[26，28]。搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵液中活菌量及抑菌能力影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)菌株CGMCC5174發(fā)酵性能的影響Fig.2 Effect of rotating speed on fermentation performance of strain CGMCC5174

由圖2可知，搖瓶轉(zhuǎn)速＜200 r/min時(shí)，培養(yǎng)液中枯草芽孢桿菌無(wú)法與溶解的氧充分接觸，活菌量及菌株產(chǎn)生抑菌性代謝產(chǎn)物都比較低；而搖瓶轉(zhuǎn)速＞200 r/min時(shí)，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞容易產(chǎn)生機(jī)械損傷，降低了發(fā)酵液中活菌量，進(jìn)而降低細(xì)菌代謝產(chǎn)物能力；搖瓶轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，發(fā)酵液中活菌量具有顯著優(yōu)勢(shì)（P＜0.05），200 r/min，250 r/min相對(duì)于其他條件抑菌圈直徑顯著優(yōu)勢(shì)（P＜0.05），但這兩組之間抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2.1.3 培養(yǎng)溫度的影響

培養(yǎng)溫度通過(guò)影響菌株生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中蛋白質(zhì)和酶的合成與活性，及其他各種生理代謝反應(yīng)，從而影響到菌體的生理活動(dòng)[26，29]。培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵液中活菌量及抑菌能力影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，42 ℃培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵活菌量影響具有顯著優(yōu)勢(shì)（P＜0.05），適宜的生長(zhǎng)溫度可以加快細(xì)菌細(xì)胞分裂，提高發(fā)酵液中活菌含量。37 ℃培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵液抑菌圈直徑影響具有顯著優(yōu)勢(shì)（P＜0.05），對(duì)代謝產(chǎn)物影響較小，可以保持代謝產(chǎn)物抑菌活性。因此，選擇最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株CGMCC5174發(fā)酵性能的影響Fig.3 Effect of culture temperature on fermentation performance of strain CGMCC5174

2.1.4 裝液量的影響

裝液量直接影響到培養(yǎng)液中溶氧量的濃度，而好氧微生物枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)繁殖階段還是分泌抑菌代謝產(chǎn)物階段都需要充足的氧氣供應(yīng)[30]。裝液量對(duì)發(fā)酵液中活菌量及抑菌能力影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 裝液量對(duì)菌株CGMCC5174發(fā)酵性能的影響Fig.4 Effect of loaded liquid on fermentation performance of strain CGMCC5174

由圖4可知，裝液量為75 mL/250 mL時(shí)菌液活菌量及抑菌圈直徑顯著高于其他條件（P＜0.05）。裝液量在25～75 mL/250 mL時(shí)，培養(yǎng)液中菌株生長(zhǎng)速度會(huì)加速，因此產(chǎn)生抑菌代謝產(chǎn)物的活性也會(huì)增加；但裝液量＞75 mL/250 mL后，培養(yǎng)環(huán)境中溶氧量降低，進(jìn)而使枯草芽孢桿菌活菌量和抑菌代謝產(chǎn)物活性降低。因此，選擇最佳裝液量為75 mL/250 mL。

2.1.5 接種量的影響

接種量對(duì)發(fā)酵液中活菌量及抑菌能力影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，接種量5.5 mL/100 mL、7.5 mL/100mL時(shí)菌液活菌量及抑菌圈直徑顯著高于其他條件（P＜0.05），但這兩組相互之間活菌量及抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。接種量在1.5～7.5 mL/100 mL時(shí)，發(fā)酵液中活菌量升高，接種量＞7.5 mL/100 mL后，發(fā)酵液中活菌量增緩，與5.5 mL/100 mL之間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），可能是因?yàn)殡S著接種量的增加，培養(yǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)消耗太快，導(dǎo)致枯草芽孢桿菌增殖過(guò)慢，菌株的代謝產(chǎn)物能力也下降[31]。因此，選擇最佳接種量為5.5 mL/100 mL。

圖5 接種量對(duì)菌株CGMCC5174發(fā)酵性能的影響Fig.5 Effect of inoculum on fermentation performance of strain CGMCC5174

2.1.6 培養(yǎng)時(shí)間的影響

培養(yǎng)時(shí)間有利于微生物生長(zhǎng)繁殖及其代謝產(chǎn)物富集，枯草芽孢桿菌長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，抑菌有效成分累積達(dá)到理想狀態(tài)，但到一定程度后，增速變緩，經(jīng)濟(jì)效益降低[32]。發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵活菌量及抑菌能力影響結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，培養(yǎng)時(shí)間為8～14 h對(duì)發(fā)酵活菌量呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng)（P＜0.05），使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖由快速生長(zhǎng)轉(zhuǎn)為穩(wěn)定發(fā)育期；培養(yǎng)26 h條件對(duì)發(fā)酵液抑菌圈直徑顯著優(yōu)勢(shì)（P＜0.05），活菌生長(zhǎng)繁殖進(jìn)入穩(wěn)定發(fā)育，但其代謝產(chǎn)物產(chǎn)量同時(shí)在增加，但培養(yǎng)時(shí)間＞26 h之后，培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物累積產(chǎn)量會(huì)制約細(xì)胞維持抑菌物質(zhì)合成的高效率，抑菌產(chǎn)物生產(chǎn)速率平緩降低。因此，選擇最佳培養(yǎng)時(shí)間為20 h。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株CGMCC5174發(fā)酵性能的影響Fig.5 Effect of fermentation time on fermentation performance of strain CGMCC5174

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以活菌量（Y1）和抑菌圈直徑（Y2）為響應(yīng)值，選取初始pH值（A）、轉(zhuǎn)速（B）、培養(yǎng)溫度（C）、裝液量（D）、接種量（E）、培養(yǎng)時(shí)間（F）6個(gè)因素，按照Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在不同發(fā)酵培養(yǎng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman experiments design for fermentation process optimization

用Minitab19.0軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，分析各因素的顯著性，結(jié)果分別見(jiàn)表4和5。由表4和5可知，當(dāng)以活菌量為響應(yīng)值時(shí)，轉(zhuǎn)速與培養(yǎng)時(shí)間有顯著影響（P＜0.05）；當(dāng)以抑菌圈直徑為響應(yīng)值時(shí)，轉(zhuǎn)速、裝液量與培養(yǎng)時(shí)間具有顯著影響（P＜0.05）。

表4 以活菌量為響應(yīng)值Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results using viable bacteria as response value

表5 以抑菌圈直徑為響應(yīng)值Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results using inhibition zone diameter as response value

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將總體滿意度值S作為綜合響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-Benhnken試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 6 Results of Box-Benhnken experiments design for fermentation process optimization

用Minitab 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到相應(yīng)的多元擬合回歸方程為S=26.253+1.551X1-0.2X2+2.3X3+0.710X12-0.713X22-0.365X32+0.150X1X2-0.692X1X3-0.005X2X3

由表7可知，該回歸模型中的F=52.35，P＜0.05，表明該多元回歸方程模型效果顯著，擬合度較佳。其中X1、X2和X3均對(duì)響應(yīng)值有顯著性影響（P＜0.05），XX3的交互作用對(duì)響應(yīng)值有顯著性影響（P＜0.05），X1與X2、X2和X3的交互作用均對(duì)總體滿意度值影響不顯著（P＞0.05）。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表7可知，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)的F=13.45，P=0.07＞0.05，說(shuō)明該模型擬合程度良好，可以預(yù)測(cè)發(fā)酵工藝最佳條件。由響應(yīng)面分析預(yù)測(cè)枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的最佳效果為總體滿意度為93.95%，最佳發(fā)酵工藝條件為搖瓶轉(zhuǎn)速248.75 r/min、裝液量74.21 mL/250 mL、培養(yǎng)時(shí)間25.31 h。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中活菌量對(duì)數(shù)理論值為8.19，發(fā)酵液抑菌圈直徑理論值為28.9 mm。

結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)工作情況，調(diào)整枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝為：搖瓶轉(zhuǎn)速250 r/min、裝液量75 mL/250 mL、培養(yǎng)時(shí)間25 h。在此工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到發(fā)酵液中活菌量對(duì)數(shù)實(shí)際值為8.03±0.6，抑菌圈直徑實(shí)際值為（28.2±1.3）mm，分別較優(yōu)化前提高了1.32倍、1.73倍。結(jié)果表明，采用滿意度函數(shù)-響應(yīng)面發(fā)多枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)活菌菌體和抑菌物質(zhì)工藝的優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

兼顧枯草芽孢桿菌CGMCC5174微生物菌體和發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)兩者的生產(chǎn)，避免資源浪費(fèi)，增加生產(chǎn)效益，降低環(huán)境污染。分析了工藝單因素下的最佳生產(chǎn)條件，并結(jié)合PB試驗(yàn)、滿意度函數(shù)分析及響應(yīng)面分析方法，避免了多個(gè)預(yù)定指標(biāo)的相互影響，排除客觀噪聲污染，這是一種快速、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性良好的生產(chǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。最后，枯草芽孢桿菌CGMCC5174最佳發(fā)酵工藝條件為：初始pH值為7.4，裝液量75 mL/250 mL，接種量為5.5 mL/100 mL，培養(yǎng)溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速為250 r/min，培養(yǎng)時(shí)間25 h。在此最佳發(fā)酵條件下，活菌量對(duì)數(shù)值為8.03±0.6，抑菌圈直徑為（28.2±1.3）mm，分別較優(yōu)化前提高了1.32倍、1.73倍。