董小君，丁 斗，甘 媛，曾富佳，丁麗娜

(遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州 遵義 563006)

近年來，慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，CKD的發(fā)生率和患病率在全球范圍內(nèi)急劇增加。CKD表現(xiàn)為腎小球濾過率降低，尿蛋白排泄增加，或兩者兼而有之[1]。以腎小管間質(zhì)纖維化(Tubulointerstitial fibrosis，TIF)和腎小球硬化為特征的腎纖維化是CKD的最終表現(xiàn)[2]，TIF的進展是一個動態(tài)過程，表現(xiàn)為腎小管丟失和細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白(包括纖連蛋白和膠原蛋白)的積聚[3]。大量的研究文獻表明，TGF-β1被認為是腎臟中最重要的纖維化細胞因子，有幾種經(jīng)典的細胞信號傳導(dǎo)途徑參與了腎纖維化，如TGF-β1/Smad，Wnt/β-catenin和Integrins/ ILK[4]。單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateral ureteral obstruction，UUO)動物模型被認為是阻塞性腎病的經(jīng)典模型，尿流受阻引起的腎小管損傷引發(fā)腎纖維化[5]。UUO動物模型的優(yōu)勢在于可通過更改實驗裝置的時間、嚴(yán)重性和持續(xù)時間來方便操控[6]。中藥復(fù)方防治UUO腎纖維化具有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點的優(yōu)勢。苓桂術(shù)甘湯以溫陽化飲、健脾利濕為用，源自《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》，原為中陽不足之痰飲而設(shè)[7]。本課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，以苓桂術(shù)甘湯為基礎(chǔ)方，加用六月雪、透骨香等貴州民族藥，擬出具有補腎健脾、通絡(luò)消癥功效的腎寧Ⅰ號方，臨床療效顯著。為進一步探討腎寧Ⅰ號方抗腎纖維化的可能作用機制，本課題采用UUO制作大鼠腎纖維化模型，通過觀察腎寧Ⅰ號方對腎組織TGF-β1/Smads信號通路中的關(guān)鍵蛋白基因如TGF-β1、Smad2、Smad7等的變化，從細胞分子層次揭示腎寧Ⅰ號方抑制腎纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性大鼠72只，體質(zhì)量(200 ± 18.56)g，購于成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：SCXK2015-030。本實驗方案通過遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，遵循實驗動物倫理委員會指導(dǎo)原則。

1.2 藥品與試劑

腎寧Ⅰ號方由茯苓、桂枝、白術(shù)、炙甘草、法半夏、黃連、大黃、六月雪、淫羊藿、透骨香、熟地、黃芪、太子參、三七、丹參、當(dāng)歸、車前子、川芎等組成，以上中藥飲片均購自成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診藥房，制成低劑量含生藥量1.76 g/mL、中劑量含生藥量3.56 g/mL、高劑量含生藥量5.58 g/mL的中藥水煎液，4℃恒溫冰箱保存；貝那普利5 mg購于成都地奧制藥集團有限公司，制成1 mg/mL的水溶液。TGF-β1(ab179695)、Smad2(ab33875)和Smad7(ab216428)抗體購于英國Abcam公司。IL-4和TNF-α試劑盒購于聯(lián)科生物科技有限公司。

1.3 動物分組與實驗方法

將72只雄性SD大鼠隨機分成6組，分別為假手術(shù)組(Ⅰ組)、模型對照組(Ⅱ組)、貝那普利陽性對照組(Ⅲ組)、低劑量腎寧Ⅰ號方組(Ⅳ組)、中劑量腎寧Ⅰ號方組(Ⅴ組)與高劑量腎寧Ⅰ號方組(Ⅵ組)。根據(jù)相關(guān)文獻報道[8]和本課題組前期經(jīng)驗，將大鼠用10%的戊巴比妥鈉麻醉后，將大鼠仰臥在加熱墊上進行皮膚準(zhǔn)備和消毒。在側(cè)面切開后，用4.0絲線縫合結(jié)扎輸尿管，最后切口用縫合線逐層封閉。假手術(shù)組的動物除結(jié)扎外均進行所有手術(shù)。實驗第2天開始進行中藥預(yù)防干預(yù)，用藥劑量按照實驗動物學(xué)的劑量換算得出，低、中、高劑量腎寧Ⅰ號方分別按生藥1.76、3.56、5.58 g/(kg·d)灌胃，持續(xù)給藥4周，貝那普利陽性對照組按1.7 mg/(kg·d)灌胃，假手術(shù)組和模型對照組每天給予3 mL的生理鹽水。

1.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)監(jiān)測

藥物干預(yù)結(jié)束后禁食8 h，禁水12 h。麻醉后從大鼠腹主動脈收集血樣。使用自動生化分析系統(tǒng)檢測血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)含量。ELISA法測量血清炎性因子IL-4和TNF-α的含量。采血后剝離腎臟標(biāo)本，固定于4%多聚甲醛，然后轉(zhuǎn)移至PBS中，依次切成5 μm的厚度進行組織學(xué)分析。用蘇木精對切片染色，測量腎損傷指數(shù)，包括間質(zhì)纖維化、炎癥、細胞浸潤、間質(zhì)水腫、腎小管萎縮、細胞液泡變性和腎小管擴張，以評估腎間質(zhì)病變。評估每個參數(shù)并給出0～4的分?jǐn)?shù)。通過Masson的三色染色評估纖維化，膠原纖維染成藍色，其他組織染成紅色。定量分析膠原沉積為膠原體積分?jǐn)?shù)(膠原面積/總面積×100%)，通過Image-Pro Plus 6.0測定。用Western blot檢測TGF-β1、Smad2及Smad7的蛋白表達，Quantitative PCR檢測TGF-β1、Smad2和Smad7的基因表達。使用 PRIMER 3.0 及 OLIGO 6.0 軟件設(shè)計引物，由武漢塞維爾公司生物合成引物，TGF-β1 Forward：catggagctggtgaaacggaag，Reverse：gactggcgagccttagtttggac；Smad2 Forward：gccgcccgaagggtagat，Reverse：ttctgttctccaccacctcctgc；Smad7 Forward：ggtgcgtggtggcatact，Reverse：gctgactcttgttgtccgaat。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腎功能檢測

如表1所示，通過BUN和Scr分析評估腎功能。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠血清BUN和Scr顯著升高(P<0.001)。與模型對照組比較，貝那普利陽性對照組和腎寧Ⅰ號方高、中、低劑量各組大鼠血清BUN和Scr顯著降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與腎寧Ⅰ號方低劑量組比較，腎寧Ⅰ號方中劑量組和高劑量組的大鼠血清BUN含量下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001或P<0.01)；而腎寧Ⅰ號方高劑量組的血清Scr含量較低劑量組下降明顯(P<0.01)，治療組之間具有顯著差異。

表1 各組實驗大鼠腎功能檢測

2.2 血清炎性因子檢測

為了評估炎癥水平，如圖1所示，檢測血清TNF-α和IL-4的濃度。模型對照組的血清TNF-α在各組中濃度最高(P<0.001)，經(jīng)腎寧Ⅰ號方治療后明顯降低(圖1(A)，P<0.001)，呈藥物濃度依賴性。此外，模型對照組的血清IL-4濃度低于假手術(shù)組，但在腎寧Ⅰ號方治療后明顯升高(圖1(B)，P<0.001)。結(jié)果表明，腎寧Ⅰ號方可改變UUO誘導(dǎo)的炎癥水平，并與藥物濃度成正相關(guān)。

注：(A) 各組實驗大鼠血清TNF-α含量； (B) 各組實驗大鼠血清IL-4含量。Ⅰ組為假手術(shù)組；Ⅱ組為模型對照組；Ⅲ組為貝那普利陽性對照組；Ⅳ組為低劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅴ組為中劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅵ組為高劑量腎寧Ⅰ號方組；n=10。與Ⅰ組比較，***P<0.001；與Ⅱ組比較，###P<0.001。與Ⅳ組比較，△△△P<0.001。

2.3 HE染色

如圖2所示，HE染色用于評估腎組織的病理變化。與假手術(shù)組相比，模型對照組大鼠腎臟主要特征是中度至重度間質(zhì)性腎炎。腎小球的數(shù)量減少，萎縮甚至硬化和壞死。腎小球中有大量的纖維組織增生，纖維組織包裹在動脈壁外。腎小管萎縮伴局部囊性擴張，大量纖維組織增生和大量炎癥在間質(zhì)細胞浸潤。然而，用腎寧Ⅰ號方治療的UUO大鼠，腎臟的整體損傷有不同程度的減弱，纖維組織的增殖得到改善，炎性細胞明顯減少。

注：Ⅰ組為假手術(shù)組；Ⅱ組為模型對照組；Ⅲ組為貝那普利陽性對照組；Ⅳ組為低劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅴ組為中劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅵ組為高劑量腎寧Ⅰ號方組。

2.4 Masson染色

如圖3(A)所示，通過Masson的三色染色評估纖維化，膠原纖維染成藍色，其他組織染成紅色，定量分析膠原沉積為膠原體積分?jǐn)?shù)(膠原面積/總面積×100%)。與假手術(shù)組相比，模型對照組大鼠的主要特征是大量膠原沉積并分布在間隙區(qū)域。用腎寧Ⅰ號方干預(yù)的UUO大鼠的間質(zhì)纖維化明顯減弱(圖3(B)，P<0.001)。在腎寧Ⅰ號方治療組的每個劑量中，膠原蛋白的含量均有不同程度的降低(P<0.001)，與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)。腎寧Ⅰ號方干預(yù)可顯著改善UUO大鼠的腎臟病理病變并減少腎臟纖維化。

注：(A) 各組實驗大鼠Masson染色；(B) Masson染色切片中膠原蛋白沉積面積的百分比(%)。 Ⅰ組為假手術(shù)組；Ⅱ組為模型對照組；Ⅲ組為貝那普利陽性對照組；Ⅳ組為低劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅴ組為中劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅵ組為高劑量腎寧Ⅰ號方組。與Ⅰ組比較，***P<0.001；與Ⅱ組比較，###P<0.001。與Ⅳ組比較，△△P<0.01，△△△P<0.001。

2.5 Western blotting法檢測

如圖4(A)和圖4(B)所示，通過Western blotting法檢測TGF-β1、Smad2和Smad7的蛋白相對表達。腎組織中的TGF-β1和Smad2蛋白表達在模型對照組中最高，而Smad7蛋白表達在模型對照組中最低，與假手術(shù)組比較均有極顯著差異(P<0.001)。經(jīng)貝那普利和各劑量的腎寧Ⅰ號方干預(yù)后，與模型對照組相比，TGF-β1和Smad2蛋白在貝那普利陽性對照組和腎寧Ⅰ號方治療各組中的表達下調(diào)，有極顯著差異(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，Smad7蛋白在貝那普利陽性對照組和腎寧Ⅰ號方治療各組中的表達上調(diào)，有極顯著差異(P<0.01或P<0.001)。各劑量腎寧Ⅰ號方治療組組間比較，相對低劑量腎寧Ⅰ號方治療組，TGF-β1蛋白表達在高劑量腎寧Ⅰ號方治療組下調(diào)，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，Smad2蛋白表達在中劑量和高劑量腎寧Ⅰ號方治療組下調(diào)，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，而Smad7蛋白表達在中劑量和高劑量腎寧Ⅰ號方治療組上調(diào)，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。

注：(A)Western blotting法測定TGF-β1，Smad2和Smad7的蛋白表達；(B)各組中的蛋白相對表達。Ⅰ組為假手術(shù)組；Ⅱ組為模型對照組；Ⅲ組為貝那普利陽性對照組；Ⅳ組為低劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅴ組為中劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅵ組為高劑量腎寧Ⅰ號方組。與Ⅰ組比較，***P<0.001；與Ⅱ組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。與Ⅳ組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.6 Quantitative PCR檢測

如圖5所示，通過Quantitative PCR法檢測TGF-β1 mRNA，Smad2 mRNA和Smad7 mRNA的相對表達。腎組織中的TGF-β1 mRNA和Smad2 mRNA表達在模型對照組中上調(diào)，而Smad7 mRNA表達在模型對照組中下調(diào)，與假手術(shù)組比較均有極顯著差異(P<0.001或P<0.01)。經(jīng)貝那普利和各劑量的腎寧Ⅰ號方干預(yù)后，與模型對照組相比，TGF-β1 mRNA和Smad2 mRNA在貝那普利陽性對照組和腎寧Ⅰ號方治療各組中的表達下調(diào)，有極顯著差異(P<0.001)，Smad7 mRNA在貝那普利陽性對照組和腎寧Ⅰ號方中高劑量治療組中的表達上調(diào)，有極顯著差異(P<0.01或P<0.001)。各劑量腎寧Ⅰ號方治療組組間比較，相對低劑量腎寧Ⅰ號方治療組，TGF-β1 mRNA表達在中劑量和高劑量腎寧Ⅰ號方治療組下調(diào)，均有極顯著差異(P<0.001)，Smad2 mRNA表達在中劑量和高劑量腎寧Ⅰ號方治療組下調(diào)，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.001)，Smad7 mRNA表達在高劑量腎寧Ⅰ號方治療組上調(diào)，有顯著差異(P<0.01)。

注：各組中的基因相對表達，Ⅰ組為假手術(shù)組；Ⅱ組為模型對照組；Ⅲ組為貝那普利陽性對照組；Ⅳ組為低劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅴ組為中劑量腎寧Ⅰ號方組；Ⅵ組為高劑量腎寧Ⅰ號方組。與Ⅰ組比較，***P<0.001；與Ⅱ組比較，##P<0.01，###P<0.001。與Ⅳ組比較，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。

3 討論

近年來，CKD的發(fā)生率和患病率在全球范圍內(nèi)急劇增加，絕大多數(shù)病例最終發(fā)展為終末期腎衰竭，嚴(yán)重威脅患者的健康和生命[9]。腎纖維化被認為是所有形式CKD的最終途徑，且?guī)缀醪淮嬖卺槍δI纖維化的特效治療方法[10]。因此，迫切需要找到有效的治療方法和藥物來預(yù)防和治療腎纖維化。目前，中醫(yī)藥已被廣泛用于對抗腎纖維化。中醫(yī)把腎纖維化歸屬于“溺毒”“關(guān)格”“水腫”等[11]，其病機關(guān)鍵為脾腎虧虛、濕濁內(nèi)蘊、瘀毒壅滯，治療上因痰飲屬陰，阻抑其陽，用陽藥化氣以伸其陽，輕清之方以通其陽，陽氣化則小便能出。本課題組集多年臨床經(jīng)驗總結(jié)出治療效果突出，具有補腎健脾、通腑泄?jié)?、活血化瘀的腎寧Ⅰ號方[7]，以苓桂術(shù)甘湯為底方，采用透骨香、六月雪等貴州苗藥加減。清代醫(yī)家陳修園在《金匱方歌括》中言：“其以茯苓為君，蓋以苓者令也，使治節(jié)之令行，而水可從令而下行，桂枝振陽以退其群陰，白術(shù)補中土以修其堤岸，使水無泛濫之虞，甘草助脾氣轉(zhuǎn)輸以交上下”。加上透骨香、六月雪活血化瘀，利濕祛毒；當(dāng)歸、丹參、三七等養(yǎng)血通絡(luò)。諸藥合用，共達通補兼施、通絡(luò)消癥之效。

TGF-β1/Smads信號通路被認為是腎間質(zhì)纖維化最經(jīng)典的信號通路[12]，其轉(zhuǎn)導(dǎo)受到一種機制調(diào)節(jié)，這種機制依賴Smad將刺激從細胞外轉(zhuǎn)移到細胞核。多數(shù)研究認為TGF-β1在腎纖維化進程中起關(guān)鍵作用，通過Smad信號通路下游激活而發(fā)揮其生物學(xué)功能[13]。目前研究[14]表明，抑制TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下調(diào)Smad2和上調(diào)Smad7可能是治療腎間質(zhì)纖維化的有效方法。Smad7具有調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路的作用，是一種自我調(diào)節(jié)的負反饋信號。Smad7抑制Smad的磷酸化，從而通過與TGF-α的競爭結(jié)合，阻止靶基因的轉(zhuǎn)錄。在本實驗中，腎寧Ⅰ號方各劑量組干預(yù)后使Smad2表達明顯降低。與之相比，腎寧Ⅰ號方各劑量干預(yù)后Smad7的基因和蛋白表達顯著上調(diào)。

綜上，本課題通過腎寧Ⅰ號方治療UUO大鼠模型及其對腎組織TGF-β1/Smads信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響發(fā)現(xiàn)，腎寧Ⅰ號方干預(yù)后能顯著降低UUO大鼠的血清BUN和Scr水平，明顯改善炎癥水平，并減輕UUO大鼠腎臟纖維化的病理病變和纖維化程度，高劑量的腎寧Ⅰ號方效果最佳。此外，腎寧Ⅰ號方的干預(yù)改變了TGF-β1、Smad 2和Smad7蛋白和基因的相對表達，提示腎寧Ⅰ號方可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路治療腎纖維化。