馮建雄 常靜 李海平 楊凡 李妍

摘要 ：油菜是我國重要的油料作物。近10年來油菜蟲害呈重發(fā)態(tài)勢，而茉莉酸可以誘導植物產生抗蟲性。本研究測定了外源茉莉酸處理對‘大黃油菜幼苗中防御酶活性以及可溶性蛋白、可溶性糖、葉綠素、單寧含量及植株生長狀況的影響。結果顯示，以100 μmol/L茉莉酸處理后，油菜葉片中過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性較對照均有提高。其中對PAL影響最大，48 h時上升為對照的2.36倍;POD和PPO活性均在12 h后達到最高，分別比對照增加了73.46%和49.21%;對SOD活性在處理后24 h比對照增加了14.93%;胰蛋白酶抑制劑（TI）活性在茉莉酸處理后48 h達到最大，比對照提高了38.37%，之后逐漸下降，至120 h時與對照無顯著差異;胰凝乳蛋白酶抑制劑（CI）活性在茉莉酸誘導后一直增加，120 h時是對照的1.78倍?？扇苄蕴呛腿~綠素含量在處理120 h均降到最低， 分別比對照降低了38.70%和17.83%?？扇苄缘鞍缀縿t先降低后升高，在處理48 h后最低，比對照降低47.98%。可溶性單寧在茉莉酸誘導后含量持續(xù)升高，在120 h時上升為對照的2.03倍。油菜根長在茉莉酸處理后28 d和35 d顯著長于對照;株高和干重均與對照無顯著差異。上述結果說明適當劑量的外源茉莉酸誘導可激活油菜的防御體系，增強其抗蟲性，且不影響油菜的生長。

關鍵詞 ：油菜; 茉莉酸; 防御酶; 營養(yǎng)物質; 可溶性單寧; 生長

中圖分類號： S 433.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019536

Effects of exogenous jasmonic acid on the activities of defense enzymes， the contents of four substances and the growth of rape

FENG Jianxiong， CHANG Jing， LI Haiping*， YANG Fan， LI Yan

（College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010019， China）

Abstract ：Rape is one of the most important oil crops in China， and the insect pests of rape have been recurring in recent decades. Jasmonic acid （JA） plays an important role in plant resistance to insects. The changes in the activities of four defense enzymes and the contents of soluble protein， sugar， chlorophyll and tannin in ‘Dahuang rape subjected to exogenous JA treatment were measured in this study. The results showed that the activities of peroxidase （POD）， polyphenol oxidase （PPO）， superoxide dismutase （SOD） and phenylalanine ammonia lyase （PAL） increased significantly in rape seedling leaves treated with 100 μmol/L of JA compared with those of the control. The effect of JA on PAL activity was the strongest among four defense enzymes， 2.36 times of the control at 48 h. POD and PPO activities reached the peak 12 h after JA treatment， which increased by 73.46% and 49.21% compared with the control， respectively. SOD activity increased by 14.93% compared to the control at 24 h. The activity of trypsin inhibitors （TI） reached its maximum 48 h after JA treatment， which increased by 38.37%， and then decreased gradually. There was no significant difference from the control in 120 h. The activity of chymotrypsin inhibitors （CI） increased after JA treatment， reaching 1.78 times of the control at 120 h. The content of soluble sugar and chlorophyll decreased to the lowest at 120 h， 38.70% and 17.83% lower than those of the controls. The soluble protein content decreased first and then increased， reaching the lowest value 48 h after JA treatment， 47.98% lower than that of the control. The soluble tannin content increased after JA treatment， reaching 2.03 times of the control at 120 h. The root length was significantly different from control after JA treatment for 28 d and 35 d， and there were no significant difference in the stem length and dry weight. The results suggested that appropriate exogenous JA dose could induce defense response and enhance resistance of rape， and there was no significant effect on the growth of rape.

Key words ：rape; jasmonic acid; defense enzymes; nutrient contents; soluble tannin; growth

茉莉酸（jasmonic acid，JA）是廣泛存在于植物體內的天然化合物[1]。作為植物防御系統的重要信號分子，JA在植物抗逆性（如抵抗昆蟲侵擾和防御機械損傷）方面起著重要作用[2]。用JA處理可以激活植物中的相應靶基因，從而增強有關防御酶活性[34]。Luo等利用病毒介導的基因沉默技術沉默了野生煙草2個JAIle羥基化酶基因，發(fā)現煙草中重要的抗蟲次生代謝物質尼古丁、胰蛋白酶抑制劑以及二萜糖苷類化合物的含量上升，使其對斜紋夜蛾 Spodoptera litura 的抗性大大增強[5]。

油菜是世界上重要的油料作物，近年來隨著人們對油菜研究的深入，油菜的用途不僅局限于提供人們的生活食用油，還擴展到飼料、工業(yè)原料、醫(yī)藥、綠肥等多個領域。油菜也是我國重要的油料作物之一，2017年全國油菜播種面積為665.30萬hm2，產量為1 327.41萬t[6]。近10年我國油菜種植面積和單產持續(xù)增長，同時油菜病蟲害總體也呈重發(fā)態(tài)勢，使油菜產業(yè)和油料安全受到重大影響[7]。

油菜上的蟲害種類很多，嚴重為害的包括桃蚜Myzus persicae （Sulzer）、蘿卜蚜Lipaphis erysimi （Kaltenbach）、甘藍蚜Brevicoryne brassicae （Linnaeus）、黃寬條跳甲Phyllotreta humilis Weise、黃曲條跳甲P.striolata （Fabricius）、油菜虱跳甲Psylliodes punctifrons Baly以及小菜蛾Plutella xylostella （Linnaeus）等，其中黃寬條跳甲是油菜苗期的重要害蟲，對油菜生產影響很大，化學防治是目前最常用的防治方法。當前，隨著國家“兩減”政策的實施，以及對綠色優(yōu)質油菜籽需求的增長，尋找安全有效防治油菜害蟲的方法成為當務之急，篩選抗蟲品種及提高植物抗蟲性可以從根本上解決這一問題。由于茉莉酸在植物抗蟲性中的重要作用，本論文研究了外源茉莉酸誘導對油菜防御酶活性和3種營養(yǎng)物質及單寧含量的影響，以及茉莉酸處理后對油菜植株生長狀況的影響，為探索使用外源茉莉酸誘導增加油菜抗蟲性，降低化學農藥的使用量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試油菜品種

‘大黃油菜（‘Dahuang rape）屬于芥菜型油菜Brassica juncea L.，是呼和浩特市武川縣的本地品種。實驗室選用蛭石和珍珠巖按1∶1混合裝入直徑20 cm的花盆中，每盆播10粒種子，待油菜長至4～6葉時選健康且長勢一致的幼苗供試。

1.2 試劑

98%茉莉酸（jasmonic acid，JA），氯化硝基四氮唑藍（NBT），L苯丙氨酸和巰基乙醇（Sigma公司）;聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和EDTANa2（Amresco公司），其余藥品均為國產分析純。

1.3 油菜幼苗處理

根據前期預試驗的結果，選擇100 μmol/L茉莉酸進行試驗。分為空白對照CK和噴施茉莉酸JA兩個處理，各處理30盆4～6葉期的幼苗。丙酮溶解茉莉酸后用蒸餾水將茉莉酸稀釋到100 μmol/L，對照選擇與處理等量的丙酮、蒸餾水混合溶液，使用小型手持噴霧器將茉莉酸和丙酮蒸餾水混合溶液分別噴施到兩個處理上，每盆噴施2 mL。在噴施后的3、6、12、24、48、72、120 h分別取樣，去除葉脈稱重后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 油菜防御酶活性測定

1.4.1 多酚氧化酶（PPO）活性測定

參考高俊鳳的方法[8]。取0.5 g葉片加入液氮，充分研磨后加入5 mL pH 6.5的PBS溶液，在4℃ 5 000 r/min離心15 min，上清液即為PPO粗酶液。吸取0.5 mL粗酶液、1.5 mL PBS、1.5 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚，對照為煮沸失活的酶液。37℃水浴10 min，立即加入3 mL 20%三氯乙酸終止反應，于525 nm下測定吸光度，以吸光度每分鐘變化0.01為一個酶活力單位，單位為U/（g·min）。

1.4.2 過氧化物酶（POD）活性測定

采用愈創(chuàng)木酚法[9]。取0.5 g葉片加入5 mL PBS（pH 7.0，0.1 mol/L），冰浴下研磨勻漿，勻漿液于4℃ 5 000 r/min離心15 min，上清液即為POD粗酶液。吸取0.1 mL酶液加入2.5 mL愈創(chuàng)木粉-H2O2混合溶液，于470 nm下測量吸光度。每隔30 s讀一次，連續(xù)讀3 min，以PBS替代粗酶液為空白對照。以吸光度每分鐘變化0.10為一個活力單位，單位為U/（g·min）。

1.4.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定

采用NBT法[8]。取0.5 g葉片加入5 mL PBS（pH 7.8，0.05 mol/L），冰浴研磨后于4℃ 10 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。在試管中加入甲硫氨酸（Met）（終濃度為13 mmol/L）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）（終濃度為10 μmol/L）、氯化硝基四氮唑藍（NBT）（終濃度為75 μmol/L）、核黃素（終濃度為2 μmol/L）和酶液并定容至3 mL，另取兩支對照管以緩沖液代替酶液。將上述對照管和一支測定管置于4 000 lx光照下反應20 min。用遮光的對照管為空白對照。以NBT為底物，以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位，單位為U/g。

1.4.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定

采用苯丙氨酸比色法[10]。取0.5 g葉片加入5 mL含5 mmol/L巰基乙醇的PBS（0.1 mol/L， pH 8.8）和少量聚乙烯吡咯烷酮（PVP），在冰浴下研磨成勻漿，于4℃ 5 000 r/min離心15 min，上清液為PAL粗提液。在試管中加入3.8 mL PBS，0.2 mL酶液，1 mL 0.6 mol/L L苯丙氨酸，對照以緩沖液代替L苯丙氨酸。反應體系在30℃水浴保溫0.5 h，加入0.2 mL 6 mol/L鹽酸終止反應。在290 nm下測定吸光度，以A290值每小時變化0.01為一個活力單位，單位為U/（g·h）。

1.4.5 胰蛋白酶抑制劑活性測定

參考張健等[11]的方法。取0.5 g葉片用TrisHCl緩沖液冰浴勻漿，于4℃ 2 000 r/min離心10 min，上清液即為抑制劑提取液。將0.4 g胰蛋白酶TrisHCl緩沖液溶解定容至50 mL，隨配隨用。取酶液100 μL和抑制劑提取液20 μL混合，于25℃水浴中反應1 h。取100 μL反應混合液加入2.9 mL含有100 μmol/L底物BAEE的TrisHCl緩沖液，于256 nm下測定吸光度值變化，單位為U/（g·min）。

TI活性=ΔA256/Ew×V×0.01

式中：ΔA256：256 nm處每分鐘吸光度變化值;V：反應體系總體積;Ew：所用酶液含量。

1.4.6 胰凝乳蛋白酶抑制劑活性測定

按照張健等[11]的方法稍作修改。取0.5 g油菜葉片加入5 mL含有苯基硫脲（0.256 mg/mL）的TrisHCl緩沖液（pH 8.0），冰浴下研磨勻漿，4℃ 12 000 r/min離心10 min，上清液即為抑制劑提取液。將40%甲醇和TrisHCl緩沖液按照1∶1混合，用混合液溶解底物BTEE，配制成含有0.5 mmol/L BTEE的底物溶液，現配現用。稱取0.185 g胰蛋白酶用TrisHCl緩沖液定容至100 mL，使用時稀釋10倍。吸取酶液50 μL和提取液80 μL混勻并于25℃恒溫水浴中保存20 min。取混合液100 μL加入2.9 mL底物溶液，于253 nm波長下測定吸光度值的變化，單位為U/（g·min）。

CI活性=ΔA253/Ew×V×0.964;

式中：ΔA253：253 nm處每分鐘吸光度變化值;0.964：1 mmol/L BTEE的吸光度;V：反應酶液總體積;Ew：所用酶液含量。

1.5 油菜營養(yǎng)物質含量測定

1.5.1 可溶性糖含量測定

采用蒽酮比色法[10]。取0.5 g葉片加入液氮研磨后置于試管中，加5 mL蒸餾水于沸水中提取30 min。待提取液恢復至室溫后5 000 r/min離心5 min，將上清液倒入25 mL容量瓶內，重復提取2次后定容。取提取液0.5 mL加入硬質試管中并加入1.5 mL蒸餾水，在冰浴中加入蒽酮乙酸乙酯試劑和5 mL濃硫酸，混勻后迅速于沸水中加熱1 min，于630 nm下測定吸光度。用葡萄糖制作標準曲線，計算可溶性糖含量，單位為mg/g。

1.5.2 可溶性蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍G250法[12]。取0.5 g葉片加入液氮研磨后移至預冷離心管，5 000 r/min離心10 min，提取上清液備用。將1.0 mL提取液加入5 mL考馬斯亮藍G250中混勻，室溫下放置2 min，于595 nm下測定吸光度。用牛血清蛋白制作標準曲線，計算可溶性蛋白質含量。

1.5.3 葉綠素含量測定

采用丙酮法[10]。取各處理葉片0.5 g放入具塞試管中，并在試管中加入丙酮和乙醇各4.5 mL和1 mL水，提取液總體積為10 mL。將試管放置黑暗條件下提取直到葉片完全變白，然后取上清液在663 nm和645 nm下測定吸光度。

葉綠素總含量=（8.02A663+20.21A645）×V/1 000×FW;

試中A663、A645：663 nm和645 nm的吸光度;V：提取液體積（mL）;FW：樣品鮮重（g）。

1.6 可溶性單寧含量測定

采用FolinCiocaileu法[13]。取油菜葉片0.5 g，裝于25 mL具塞試管中，加水約25 mL，放在60℃左右的保溫箱中過夜。第2天，過濾提取液至50 mL容量瓶中;加入5 mL 80℃左右的蒸餾水，置于80℃水浴鍋中浸提20 min，反復浸提3～5次并定容至50 mL，即為單寧提取液。吸取1 mL單寧提取液加入7.5 mL蒸餾水，混勻后再加入0.5 mL FolinCiocaileu顯色劑，搖勻并放置3 min，加入1 mL飽和碳酸鈉。室溫下放置1 h后在750 nm下測定吸光度。用單寧酸制作標準曲線，單位為mg/g。

1.7 油菜幼苗生長狀況測定

油菜噴施JA溶液后，每隔7 d分別測定油菜的株高、根長及干重，每次測定10株，3次重復，共測定35 d。

1.8 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2010軟件對數據進行匯總和處理，采用SPSS 12.0.1統計分析軟件對數據進行方差分析，采用Duncan氏法對不同處理之間進行多重比較，處理與對照之間的差異顯著性采用t測驗;其顯著水平設P<0.05。

2 結果與分析

2.1 茉莉酸誘導對油菜幼苗葉片防御酶活性的影響

茉莉酸誘導后油菜葉片中4種防御酶活性的變化見圖1。4種防御酶活性基本都呈現先上升后下降的趨勢。其中PAL活性變化最大，在48 h達到最大728.00 U/（g·h），顯著高于對照（P<0.05），是對照的2.36倍。POD活性12 h達到最高峰81.69 U/（g·min），比對照增加了73.46%。 PPO活性在誘導12 h后達到了最高值27.45 U/（g·min），比對照增加了49.21%。SOD活性變化最小，24 h時比對照增加14.93%。

2.2 茉莉酸誘導對油菜幼苗蛋白酶抑制劑活性的影響

胰蛋白酶抑制劑（TI）的活性僅在處理后48 h顯著高于對照（P<0.05），升高了38.37%，其他時間點與對照無顯著差異。胰凝乳蛋白酶抑制劑（CI）活性在茉莉酸誘導72 h和120 h時均顯著高于對照（P<0.05），分別是對照組的1.83倍和1.78倍（圖2）。

2.3 茉莉酸處理對油菜幼苗葉片中營養(yǎng)物質含量的影響

由圖3可以看出，外源茉莉酸處理可使油菜葉片可溶性蛋白、可溶性糖和葉綠素含量較對照顯著降低（P<0.05）?？扇苄蕴呛吭谲岳蛩崽幚砗蟪尸F逐漸下降的趨勢，120 h降到最低值3.12 mg/g， 比對照降低了38.70%?？扇苄缘鞍缀縿t呈現先降低后升高的趨勢，在茉莉酸處理48 h達到最低值6.62 mg/g，比對照降低了47.98%。葉綠素含量呈降低趨勢，在120 h達到最低值0.65 mg/g，比對照降低了17.83%。

2.4 茉莉酸處理對油菜幼苗葉片中可溶性單寧含量的影響

茉莉酸處理可使油菜葉片可溶性單寧含量顯著增高（P<0.05），在120 h單寧含量達到了1.01 mg/g，是對照的2.03倍（圖4）。

2.5 茉莉酸處理對油菜幼苗生長的影響

在茉莉酸處理后28 d和35 d，油菜根長顯著高于對照（P<0.05），其他時間均無顯著差異。茉莉酸處理對油菜株高和干重均無顯著影響（表1）。

3 討論

茉莉酸在自然界廣泛存在，無論是天然還是外源茉莉酸，都對植物有誘導抗性、促進衰老等生理功能[1415]。很多研究已經證實茉莉酸在植物抗蟲性中具有重要作用。

PPO能夠催化多酚化合物次生代謝，降低植物的營養(yǎng)價值，阻止昆蟲取食[1617]。桂連友等研究發(fā)現外源JA可以誘導茶樹葉片內PPO活性增高，茶尺蠖Ectropis obliqua取食JA處理的葉片后生長受到明顯抑制[18]。JA處理可誘導番茄葉片中的PPO活性增加，取食JA處理葉片的煙草天蛾Manduca sexta幼蟲生長受到抑制[19]。王杰等的研究也有相似的結論[20]。本研究也發(fā)現，在外源茉莉酸誘導后，油菜體內多酚氧化酶（PPO）活性在誘導12 h后增加了49.21%。PPO參與酚類化合物的氧化，這種氧化作用與細胞壁伸展蛋白的偶聯有關，因此PPO活性升高可增強油菜細胞壁的強度，從而提高植物的抗蟲性。

外源茉莉酸處理油菜幼苗葉片后POD活性顯著增加，該結果與王俊斌等在煙草葉片、段文昌等在枸杞葉片、田旭濤等在番茄和菜豆葉片上的結果一致[2123]。POD在植物防御中的作用是多方面的，其產生的醌類和其他氧化物可以與任何的游離氨基酸或蛋白質側鏈反應以減少植物對昆蟲的吸引。

PAL是連接初級代謝和苯丙烷類代謝并促進苯丙烷類代謝第一步反應的酶，是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶[24]。苯丙烷類代謝的中間產物經過一系列反應可轉化為木質素、黃酮、生物堿等次生代謝物，一般這些次生代謝物被認為在物理和化學方面對植物生長發(fā)育和抗蟲抗病性起著重要作用。SOD在植物清除活性氧方面起著重要作用，植物的抗逆性與植物體內能否維持較高SOD活性有關。段文昌等發(fā)現，外源茉莉酸誘導可顯著提高枸杞葉片中PAL和SOD的活性[22]。楊世勇等用茉莉酸誘導棉花發(fā)現PAL活性增強[25]。同樣用茉莉酸甲酯誘導巨桉幼苗也使巨桉葉中4種防御酶活性增強[26]，與本研究的結果一致。

蛋白酶抑制劑在植物抗蟲性中是重要的化學防御物質之一。很多研究發(fā)現，茉莉酸在不同植物中均可以誘導植物蛋白酶抑制劑活性上升。胡留成等研究發(fā)現，外用茉莉酸甲酯處理能系統性增強油菜胰蛋白酶抑制劑活性[27]。越慧芳等的研究也表明，不同濃度的外源茉莉酸處理青楊葉片后，胰凝乳蛋白酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑活性較對照均顯著增加[28]，本論文也有相似結論。蛋白酶抑制劑是植食性昆蟲獲取蛋白質難以克服的障礙，因此被作為茉莉酸處理后產生誘導抗性的標志[29]。

植物體內的營養(yǎng)物質是維持植物體正常運轉必需的物質，也是植食性昆蟲獲取營養(yǎng)的主要來源。茉莉酸誘導會降低植物中主要營養(yǎng)物質的含量，使昆蟲不能獲得足夠的營養(yǎng)，從而達到抗蟲的目的。王予彤等在青楊上，李順欣等在菜豆葉片上，宮玉艷等在枸杞葉片上以及孫興華等在黃瓜葉片上的研究已經證實[3033]。植物防御是一個消耗能量的過程，植物在需要時才加以防御，是一種經濟上可行的策略。本研究表明外源茉莉酸誘導會降低油菜體內可溶性蛋白和可溶性糖的含量，是該策略在實際操作中的具體體現形式[29]。

單寧是植物中常見的次生代謝物，能與昆蟲唾液蛋白和消化酶結合，降低植物適口性，阻礙昆蟲對寄主植物營養(yǎng)物質的消化和吸收[34]。外源茉莉酸可以使油菜葉片中可溶性單寧的含量明顯上升，與嚴俊鑫等[35]在重瓣玫瑰上，宮玉艷等[32]在枸杞葉片上得到的結果一致。

除抗逆作用外，茉莉酸在植物生長上也有作用，如誘導植物開花結果，或是促進株高、根系的生長。植物體內的JAs可以增高POD的活性從而促進側生根的生長[36]。本研究結果表明，茉莉酸處理28 d和35 d 后油菜根長顯著高于對照，對株高、干重沒有明顯的促進作用。這可能是由于茉莉酸處理降低了油菜體內一些營養(yǎng)物質的含量，從而導致其對植物生長沒有明顯的促進作用。

目前的研究表明，外源茉莉酸處理不同植物后會增加植物體內抗蟲性物質含量，提高植物的抗蟲性。田旭濤等研究發(fā)現， 0.1、1 mmol/L 茉莉酸處理菜豆，顯著降低了美洲斑潛蠅成蟲對菜豆的取食和產卵選擇性[37]，茉莉酸誘導在葡萄抗根瘤蚜[38]、菜豆抗西花薊馬[31]、茶樹抗茶尺蠖[18]等研究中也有相似的結果。但目前這些結果都是實驗室內的研究結果，和茉莉酸的濃度有密切的關系，在大田當中使用是否有相同的結果，成本是否合適等，沒有明確的結論。外源茉莉酸誘導后油菜體內的防御酶活性和一些物質含量發(fā)生了明顯的變化，但油菜對黃寬條跳甲的抗蟲性是否增加，在大田中是否有應用的可能性，還有待進一步更深入的研究。

油菜是我國重要的油料作物之一，我國油菜種植主要分為春油菜和冬油菜，其中春油菜主要分布在我國西北部地區(qū)，如內蒙古、青海、甘肅等地。內蒙古作為春油菜的主產地之一，冬季氣候干燥、夏季冷涼濕潤、日照強、晝夜溫差大，適宜于春油菜的種植。且這樣的氣候條件也造就了春油菜良好的品質優(yōu)勢：含油量高，對人體有益的亞油酸含量高，因此油菜產業(yè)在內蒙古地區(qū)占有非常重要的地位。另外油菜在內蒙古地區(qū)還有觀光、綠肥等特殊用途。因此降低油菜病蟲害的發(fā)生，減少化學農藥的使用，尋找安全有效的蟲害防治方法，對滿足綠色油菜籽的生產需求和促進油菜產業(yè)的發(fā)展都有重要的意義。

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（責任編輯：田 喆）