秦丹丹 王俊 高海峰 李寧靜 吳偉 劉太國 陳萬權(quán) 高利

摘要 ：小麥網(wǎng)腥黑穗病是由小麥網(wǎng)腥黑粉菌Tilletia caries引起，會導(dǎo)致小麥嚴(yán)重減產(chǎn)。為了獲得小麥網(wǎng)腥黑穗病較高的發(fā)病率，本研究利用穗部接菌、土壤接菌、根部接菌3種方法進(jìn)行溫室內(nèi)人工接種小麥。結(jié)果表明，利用穗部接菌及土壤接菌發(fā)病率分別為52.5%和10%，而根部接菌發(fā)病率僅有4%。利用穗部接菌可以獲得更多的發(fā)病植株，為更好地研究寄主與病原的互作關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ：小麥網(wǎng)腥黑粉菌; 人工接菌; 溫室; 發(fā)病率

中圖分類號： S 435.121.44

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019563

Exploring of the artificial inoculation methods of Tilletia caries

QIN Dandan1， WANG Jun2， GAO Haifeng3， LI Ningjing2， WU Wei4，LIU Taiguo1， CHEN Wanquan1， GAO Li1*

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy

of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2. Plant Protection Station of Xinjiang

Uygur Autonomous Region，

Urumqi 830049， China; 3. Institute of Plant Protection， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091，

China; 4. Agricultural Technology Promotion Station of Xinyuan County， Xinjiang， Yili 835800， China）

Abstract ：Tilletia caries can lead to common bunt of wheat and it can causes severe wheat yield reduction. In order to obtain the diseased plants of T.caries， three methods including tassel inoculation， soil inoculation and root inoculation were used to artificially inoculate in greenhouse. The results showed that disease incidence with tassel inoculation and soil inoculation was 52.5% and 10%， but the disease incidence with root inoculation was only 4%. More diseased plants can be obtained by using tassel inoculation， which lays a foundation for better research on the interaction between the host and the pathogen.

Key words ：Tilletia caries; artificial inoculation; greenhouse; diseaseincidence

小麥腥黑穗病是世界性病害，在春小麥及冬小麥上都有發(fā)生，遍布世界小麥種植區(qū)[1]。在我國常見的是Tilletia caries （DC.） Tul. & C. Tul.引起的小麥網(wǎng)腥黑穗病和Tilletia foetida （Wall.） Liro引起的小麥光腥黑穗病。小麥網(wǎng)腥黑穗病主要發(fā)生在江蘇、山西、山東、河南等地，被黑龍江、山東、河南、天津等多省市列為補(bǔ)充植物檢疫性有害生物[2]。在小麥成熟期，病穗中幾乎都是呈籽粒狀的孢子團(tuán)（菌癭），成熟的孢子團(tuán)全部由冬孢子組成并被薄且修飾過的子房壁包被形成典型的菌癭，菌癭比正常小麥的籽粒圓、大[3]。小麥成熟末期，干燥的菌癭呈近球形，破碎后的冬孢子呈塊狀[46]。感染腥黑粉菌之后的小麥麥粒散發(fā)臭魚腥味，并且釋放出有毒的三甲胺類物質(zhì)，嚴(yán)重影響小麥品質(zhì)，給小麥生產(chǎn)帶來巨大損失[79]。目前國內(nèi)對于小麥網(wǎng)腥黑穗病的研究較少，探究溫室條件下人工接種獲得發(fā)病植株的方法，對于研究該病菌的致病性及與寄主的互作機(jī)理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥網(wǎng)腥黑粉菌及供試小麥品種‘東選3號由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 小麥網(wǎng)腥黑粉菌冬孢子的萌發(fā)培養(yǎng)

干燥的病穗于室溫條件下保存。于病穗采集后20、30 d和40 d分別進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。冬孢子的萌發(fā)率均超過90%，表明冬孢子活性良好。將4～6個小麥網(wǎng)腥黑粉菌菌癭（視菌癭大小而定）放入一個2 mL的離心管中，加入2 mL滅菌水并經(jīng)150目紗布過濾掉雜質(zhì)，制成冬孢子懸浮液。浸泡24 h后將冬孢子懸浮液10 000 r/min離心1 min去上清液，加入2 mL 0.25% NaClO溶液消毒5 min，不定時輕搖以保證處于混勻狀態(tài)。離心后棄上清液并加入2 mL無菌水，重復(fù)洗滌3次獲得最終的懸浮液。利用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡（Leica S6D，德國）下測定并計(jì)算冬孢子懸浮液的濃度，適當(dāng)稀釋后將冬孢子濃度調(diào)節(jié)至106個/mL的數(shù)量級備用[10]。

按1%的比例在冷卻至40～50℃的水瓊脂培養(yǎng)基（規(guī)格為2 000 mL的燒杯中加入16 g瓊脂，加蒸餾水定容至1 L，分裝后121℃高壓蒸汽滅菌20 min）中混入青霉素、鏈霉素雙抗并倒板，每個培養(yǎng)皿中加200 μL 106個/mL冬孢子懸浮液，用滅菌的涂布棒涂布均勻并封口。所有平板置于16℃、光照300 μmol/（m2·s）、相對濕度50%的人工培養(yǎng)箱（MLR352H， 日本）中培養(yǎng)。

1.3 供試小麥的春化處理

將小麥種子浸泡催芽24 h，用30%的NaClO溶液表面消毒1～5 min，以殺滅種子表面攜帶的病原菌，然后用滅菌水沖洗小麥種子直至無味。將過夜催芽的種子置于玻璃培養(yǎng)皿中，用濕潤的紗布覆蓋保濕，用錫紙包裹于4℃光照培養(yǎng)箱（HYC360， 海爾中國）中避光春化4周，直至胚芽鞘長至1～3 cm。

1.4 供試小麥的種植

將春化好的麥苗種于盛有滅菌土的直徑20 cm的花盆中，深度約3 cm，每盆種10株，置于超低溫植物生化培養(yǎng)箱（LT36VL， Percival， 美國）中24 h全光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為300 μmol/（m2·s）。種苗初期，培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度控制在10～12℃，7 d后，待幼苗穩(wěn)定后溫度可調(diào)整為15～17℃，當(dāng)小麥苗生長至孕穗期時生化培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度可調(diào)節(jié)為20～25℃，每天保持水分供應(yīng)，防止低溫和干旱對小麥穗部發(fā)育的影響，定時觀察麥苗的長勢。

1.5 小麥網(wǎng)腥黑粉菌室內(nèi)人工接種方法研究

1.5.1 穗部接菌法

制備菌絲懸浮液：將培養(yǎng)7 d的T.caries平板置于全自動倒置研究級顯微鏡（IX83， OLYMPUS， 日本）下觀察冬孢子萌發(fā)情況。挑取長出侵染菌絲的平板，每個培養(yǎng)皿加入5 mL滅菌水刮取菌絲，在600 nm波長下檢測溶液OD值，用蒸餾水調(diào)整OD600為0.1～0.2，用于接菌[11]。

穗部接種：待小麥苗孕穗期開始時，即小麥旗葉葉片全部從倒二葉葉鞘內(nèi)伸出時用注射器將1 mL菌絲懸浮液注射入小麥植株旗葉與幼穗之間的空腔內(nèi)，連續(xù)接種5 d，共接菌40株小麥，待小麥成熟后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。

1.5.2 土壤接菌法

種植已春化的麥苗，種植3 d后用注射器吸取T.caries菌絲懸浮液（菌絲懸浮液的制備同穗部接菌法）注射到小麥苗根部土壤中，對40株小麥進(jìn)行土壤接菌，每天注射2 mL，連續(xù)注射5 d，待小麥成熟后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，每株小麥無論主穗或分蘗穗發(fā)病均視為該株小麥成功發(fā)病，主穗及分蘗穗均未發(fā)病則視該植株未發(fā)病。

1.5.3 根部接菌法

用30%的NaClO溶液對浸泡催芽的小麥種子消毒后，于無菌操作臺中將40粒小麥種子分4組置于有70% T.caries冬孢子萌發(fā)的平皿上，將胚芽鞘一面與菌絲充分接觸，每個平皿放10粒種子，進(jìn)行根部接菌，密封好后置于4℃條件下邊侵染邊春化。4周后將春化好的小麥苗種在滅過菌的土壤中，待小麥成熟后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率（統(tǒng)計(jì)方法同土壤接菌法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥網(wǎng)腥黑粉菌的人工接種體系

通過掃描電鏡確認(rèn)該菌為小麥網(wǎng)腥黑粉菌（圖1a）。小麥網(wǎng)腥黑粉菌冬孢子在水瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，2 d后利用全自動倒置顯微鏡觀察其萌發(fā)過程，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3 d后冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生先菌絲（圖1b），然后在先菌絲頂部長出大量傘狀的初生擔(dān)孢子（圖1c），形成密集的一束，隨后相反交配型的初生擔(dān)孢子融合形成“H”體（圖1d），致病的雙核期開始?！癏”體產(chǎn)生大量的臘腸狀次生擔(dān)孢子（圖1e），隨后次生擔(dān)孢子萌發(fā)產(chǎn)生大量侵染菌絲（圖1f），此時的侵染菌絲致病力較強(qiáng)，收集該時期的菌絲用于接種小麥（圖1g），小麥成熟后可觀察到整個籽粒充滿了黑色冬孢子（圖1h）。

2.2 室內(nèi)人工接種方法的研究

人工接種后發(fā)病的小麥植株高度同正常植株相比無明顯變化，菌絲成功侵染后小麥子房呈現(xiàn)深綠色，而健康的子房呈淺綠色，發(fā)病植株穎殼外張，露出黑色的籽粒（圖1h），小麥籽粒組織被黑粉取代形成菌癭，菌癭碾碎后散發(fā)出魚腥味。不同的接種方法植株的發(fā)病率不同，利用穗部接菌法可以獲得52.5%的發(fā)病植株，利用土壤接菌法和根部接菌法分別獲得了10%和4%的發(fā)病植株（表1）。因此，通過穗部注射菌絲懸浮液可以獲得更多的發(fā)病植株。

3 討論

小麥網(wǎng)腥黑粉菌萌發(fā)的最佳溫度范圍為14～16℃，最適宜溫度為16℃，在此條件下4 d就可以萌發(fā)，溫度太高或太低、濕度太大或太小都會對冬孢子的萌發(fā)產(chǎn)生影響[12]。姚卓等通過室內(nèi)接菌成功獲得了小麥矮腥黑粉菌的發(fā)病植株，并研究出小麥矮腥黑粉菌萌發(fā)最適的冬孢子懸浮液濃度為1×106個/mL[10]。本試驗(yàn)以上述條件作為參考，在短時間內(nèi)獲得了T.caries的菌絲懸浮液，提高了試驗(yàn)效率。國內(nèi)學(xué)者從土壤濕度[13]、溫度敏感性[14]、無積雪條件下發(fā)病狀況[15]等方面，研究并確定了影響小麥矮腥黑粉菌萌發(fā)和生長的環(huán)境條件。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)深播條件下普通腥黑穗?。ㄓ尚←湽庑群诜劬托←溇W(wǎng)腥黑粉菌引起的黑穗病統(tǒng)稱普通腥黑穗病）發(fā)病率明顯高于淺播;播種在溫暖的土壤中，普通腥黑穗病的發(fā)病率會顯著降低[1617]。試驗(yàn)中土壤接菌時選擇在苗期進(jìn)行，是因?yàn)樵谄渖L前期根未扎深時菌絲與小麥根部能夠充分接觸。

本試驗(yàn)土壤接菌法僅獲得了10%的侵染率，可能是由于土壤的pH、濕度等條件限制菌絲的活性，導(dǎo)致菌絲未能侵染到小麥的生長點(diǎn);或者菌絲的侵染期與小麥的感病期不一致，導(dǎo)致菌絲無法成功侵染;有研究表明，在植株分蘗開始時或者僅有幾個分蘗時對小麥矮腥黑粉菌最敏感[18]，本試驗(yàn)土壤接菌法侵染率低的原因可能是隨著小麥的生長，根深扎在土壤中，而用注射器接菌時菌液注入在土壤表層無法深入。根部接菌法侵染率較低的原因可能是菌絲與根的接觸面積不夠，根在平板上生長過程中會伸到瓊脂下層，導(dǎo)致瓊脂表面的菌絲無法與根接觸，從而無法成功侵染。而穗部接菌法采用的是在孕穗期注射菌絲懸浮液，使得穗部組織與菌絲能充分接觸，擺脫了土壤條件對菌絲侵染的限制，從而獲得了較高的發(fā)病率。

傳統(tǒng)的方法是將小麥種子與冬孢子粉混合，加入甲基纖維素溶液增加冬孢子黏性來接種;Gaudet等將冬孢子與土壤混合（4 g冬孢子/100 cm3土壤），每米行長施用4 cm3，然后在該土壤上種植小麥進(jìn)行接種[19]。以上接菌方法易受土壤條件的限制，導(dǎo)致冬孢子萌發(fā)率低，從而降低了菌絲的侵染率。本試驗(yàn)的穗部接種法菌絲與穗部直接接觸，擺脫了土壤環(huán)境對冬孢子萌發(fā)的限制，獲得了更多的發(fā)病植株。因此，利用穗部接菌法可以提高接種的發(fā)病率，且操作簡便易行，需要的菌量明顯少于土壤接菌法，可減少工作量，縮短試驗(yàn)周期。本文結(jié)果為更好地研究寄主與病原的互作關(guān)系奠定基礎(chǔ)，對揭示病原物致病性的遺傳基礎(chǔ)和深入了解致病基因的表達(dá)方式有十分重要的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 郭同軍， 邢巍婷， 石慶華， 等. 小麥網(wǎng)腥黑粉菌冬孢子總DNA提取方法比較[J]. 生物技術(shù)， 2007（5）：3538.

[2] 劉剛. 全國部分省市發(fā)布新的補(bǔ)充農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單[J]. 農(nóng)藥市場信息， 2010（4）：50.

[3] HOFFMANN J A. Bunt of wheat [J]. Plant Disease， 1982， 66（11）：979986.

[4] WILCOXSON R D， SAARI E E. Bunt and smut diseases of wheat： concepts and methods of disease management [R]. Centro Internacional de Mejoramiento de Maizy Trigo （CIMMYT）， 1996.

[5] TYLER L J， JENSEN N F. Some factors that influence development of dwarf bunt in whiter wheat [J]. Phytopathology， 1958， 48：565571.

[6] MCNEIL M， ROBERTS A M I， COCKERELL V， et al. Realtime PCR assay for quantification of Tilletia caries contamination of UK wheat seed [J]. Plant Pathology， 2010， 53（6）：741750.

[7] YOUNG P A. A new variety of Tilletia tritici in Montana [J]. Phytopathology， 1935， 25：40.

[8] TRIONE E J， HESS W M， STOCKWELL V O. Growth and sporulation of the dikaryons of the dwarf bunt fungus in wheat plants and in culture [J]. Canadian Journal of Botany， 1989， 67（6）：16711680.

[9] MATHRE D E. Dwarf bunt： politics， identification， and biology [J]. Annual Review of Phytopathology， 1996， 34：6785.

[10]姚卓， 陳萬權(quán)， 高利， 等. 小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發(fā)和室內(nèi)人工接種方法的探索[J]. 植物保護(hù)， 2014， 40（3）：122126.

[11]臧憲朋， 徐幼平， 蔡新忠. 一種基于菌絲懸浮液的核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）接種方法的建立[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）， 2010， 36（4）：381386.

[12]GOATES B J， HOFFMANN J A. Nuclear behavior during teliospore germination and sporidial development in Tilletia caries， T.foetida， and T.controversa [J]. Canadian Journal of Botany， 1987， 65：512517.

[13]賈文明， 周益林， 段霞瑜， 等. 土壤濕度對小麥矮腥黑穗病菌（T. controversa）冬孢子萌發(fā)的影響[J]. 植物保護(hù)， 2006， 32（6）： 4851.

[14]江輝， 周益林， 段霞瑜. 小麥矮腥黑穗病菌對溫度的敏感性[J]. 植物保護(hù)， 2012， 38（2）：120123.

[15]王圓， 俞曉霞. 小麥矮腥黑穗病在無積雪條件下發(fā)病的研究[J]. 植物檢疫， 1996（3）：1214.

[16]PURDY L H， KENDRICK E L， HOFFMANN J A， et al. Dwarf bunt of wheat [J]. Annual Reviews in Microbiology， 1963， 17（1）：199222.

[17]GAUDET D A，PUCHALSKI B J. Influence of planting dates on the aggressiveness of common bunt races（Tilletia and T. laevis） to Canadian spring wheat cultivars [J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 1990， 12（2）：204208.

[18]HOFFMANN J A， PURDY L H. Effect of stage of development of winter wheat on infection by Tilletia controversa [J]. Phytopathology， 1967， 57（4）：410413.

[19]GAUDET D A， PUCHALSKI B J， ENTZ T. Effect of environment on efficacy of seedtreatment fungicides for control of common bunt in spring and winter wheat [J]. Pesticide Science， 1989， 26（3）： 241252.

（責(zé)任編輯：楊明麗）