郎倩倩，徐振強，張 燕，張德祥1,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東廣州 510640；3.廣東溫氏南方家禽育種有限公司，廣東新興 527400）

腹脂過度沉積已成為現(xiàn)代肉雞生產(chǎn)面臨的一個嚴(yán)峻問題[1]，對黃羽肉雞腹脂性狀的選擇方法目前主要有直接選擇、間接選擇和分子標(biāo)記輔助選擇。研究顯示，腹脂重和腹脂率具有較高的遺傳力，對其進行直接選擇能夠取得較為理想的效果[2-3]，但直接選擇法測定難度大，較難推廣應(yīng)用。間接選擇法主要是通過對與腹脂性狀相關(guān)性較強的其他性狀的選擇來達到間接選擇腹脂的目的，如體尺性狀、飼料報酬性狀等[4]。

雞的腹脂沉積是一個復(fù)雜的生理過程，與脂肪代謝有關(guān)的基因及其在脂肪沉積中的作用研究一直備受關(guān)注。在分子水平上挖掘與腹脂性狀相關(guān)的基因，找到一些分子標(biāo)記，能為解決腹脂過度沉積問題提供一定依據(jù)。經(jīng)過多年研究，學(xué)者們也發(fā)現(xiàn)了許多與腹脂性狀有關(guān)的基因。邵勇鋼等[5]研究表明A-FABP基因多態(tài)性與拜城油雞的腹脂性狀存在一定的相關(guān)性；李耀輝[6]研究發(fā)現(xiàn)，BMP6基因的2 個多態(tài)位點（g.64475440C＞T 和g.64474334G＞C）與試驗群體的腹脂重存在一定的相關(guān)性；薛倩等[7]研究表明甲狀腺激素應(yīng)答蛋白Spot 14（THRSPα）基因中的C129T 和T160G 2 個突變位點與京海黃雞的腹脂性狀相關(guān)聯(lián)（P＜0.05 和P＜0.01）。以上研究發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點都能夠作為分子標(biāo)記對腹脂性狀進行輔助選擇，進而為優(yōu)質(zhì)雞的腹脂選擇提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

長鏈酯酰輔酶A 合成酶（ACSLs）是長鏈脂肪酸通過硫代酯化進而合成?；o酶A 衍生物所必需的酶，也是脂肪酸代謝的第一步[8]。哺乳動物ACSL 家族由ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5 和ACSL6 組成，其中ACSL1 是主要的異構(gòu)體之一，主要存在于能量代謝組織中，在骨骼肌、肝臟和脂肪組織中都有表達，可以調(diào)節(jié)機體的能量代謝[9]。同時，ACSL1在脂肪酸的活化、轉(zhuǎn)運和降解以及脂類生成等過程中也至關(guān)重要[10]。有研究報道，ACSL1在心臟和脂肪組織β氧化過程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。

綜合可知，ACSL1基因在脂類代謝中有著一定的作用[12]。故本研究在前人研究基礎(chǔ)上，采用PCR-直接測序技術(shù)對黃羽肉雞ACSL1基因（雞ACSL1基因位于4 號染色體上，全長37 027 bp，共有23 個外顯子）進行遺傳多態(tài)性分析，選出與腹脂性狀相關(guān)的SNP 位點，為黃羽肉雞腹脂性狀的分子標(biāo)記選擇提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇1 日齡天露黃雞N409 品系共500只母雞，由廣東溫氏南方家禽育種有限公司提供。雞群飼養(yǎng)于廣東溫氏南方家禽育種有限公司肉雞試驗場，地面平養(yǎng)，飼養(yǎng)期105 d。全程按廣東溫氏南方家禽育種有限公司肉雞飼養(yǎng)模式進行。1～42 日齡飼喂黃小料，43～49 日齡由黃小料逐步向黃肉料過渡，50～105 日齡飼喂黃肉料。日糧營養(yǎng)水平見表1。飼養(yǎng)過程中淘汰僵雞、殘次雞，并記錄死淘雞只數(shù)量和翅號。

表1 日糧營養(yǎng)成分

1.2 實驗試劑 實驗試劑包括2×Easy Taq SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DEPC 處理水、離心管及槍頭購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；核酸染料，購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司；DL 2000 DNA Ladder Marker，瓊脂糖（Agarose）購自普博生物技術(shù)有限公司；E.Z.N.ATM NRBC Blood DNA Kit 購自O(shè)mega 公司；無水乙醇購自廣州化學(xué)試劑廠。

50×TAE Buffer（pH 8.5）：稱量 242 g Tris，加ddH2O至約800 mL，充分溶解，加4 mL 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）和57.1 mL 冰醋酸，加ddH2O 至1 000 mL，貯存于室溫。

0.5mol/L EDTA（pH 8.0）：稱取168.1 g Na2EDTA·2H2O置于1L 的燒杯中；加入約800 mL 去離子水，充分溶解后用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至8.0，然后加去離子水定容至1L 后高壓滅菌，室溫保存。

1.3 實驗儀器 Bio-Rad S1000 PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；Eppendorf 微量移液器，購自德國Eppendorf公司；電子分析天平購自德國Sartorius 公司；Rios 純水系統(tǒng)購自美國Millipore 公司；高壓滅菌鍋HV-85 購自HIR AYAMA 公司；微波爐購自廣州格蘭仕生活電器有限公司；小型高速離心機購自Eppendorf 公司；凝膠電泳儀購自BIO-RAD 公司；4℃冰箱購自SIEMENS 公司；-20℃低溫冰箱購自日本SANYO 公司；制冰機購自日本SANYO 公司；一次性注射器購自廣州竺祥生物科技有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋購自浙江臨海市東方儀器廠；XW-80 型漩渦混合器購自上海第一醫(yī)學(xué)院儀器廠；GDS-8000PC 凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP 公司。

1.4 測定方法 在105 日齡，測定500 只母雞的體重、體尺性狀（胸寬、骨盆寬、體斜長、脛長）。與此同時，用一次性醫(yī)用1.5 mL 注射器于翅下靜脈采血，將采得的1 mL 血樣裝入放有2%EDTA 的離心管中，與翅號對應(yīng)，充分搖勻，并于-20℃冰箱中保存。采血完成后，進行屠宰實驗，測定全凈膛重、腹脂重、皮脂厚。所有指標(biāo)的屠宰測定方法均根據(jù)《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計方法》（NY/T 823-2004）執(zhí)行[12]。

1.5 血樣DNA 抽提 根據(jù)OMEGA 試劑盒血樣DNA提取說明書抽提DNA，并放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 引物設(shè)計合成 根據(jù)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的紅色原雞ACSL1基因的序列（Gene ID：422547），利用Oligo7.0 軟件設(shè)計多對引物，用于擴增ACSL1基因的外顯子區(qū)（Exon），并送至北京六合華大基因科技股份有限公司合成引物。引物信息如表2 所示。

1.7 DNA 混池組建以及SNP 位點篩選 選取腹脂重兩尾的72 個個體，其中高腹脂的36 個個體隨機分成6 組，每組均為高腹脂，低腹脂的36 個個體也隨機分成6 組，每組均為低腹脂，總共有12 組混池。

對PCR 產(chǎn)物直接測序以檢測每組混池中的SNP 位點。所用試劑為2×Easy Taq SuperMix 和ddH2O，引物信息見表2，40 μL 混池擴增反應(yīng)體系：2×Easy Taq SuperMix 20 μL、DNA 模板1 μL（50 ng/μL）、上下游引物各0.4 μL（0.1 μmol/L），ddH2O 補充至40 μL。

PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；退火30 s；72℃延伸Y s（產(chǎn)物長度不同，延伸時間也不同，1 kb/min），36 個循環(huán)；72℃再延伸5 min；最后4℃保存，所有擴增反應(yīng)均在S1000TM Thermal Cycler PCR儀中進行。

將擴增成功的產(chǎn)物送于測序公司進行測序，根據(jù)PCR 產(chǎn)物的測序結(jié)果，利用DNAStar 中的SeqMAN 程序進行序列和峰圖對比，篩選出SNP 位點，選取SNPs較豐富的片段進行SNPs 分型。

表2 引物信息

1.8 實驗群體SNP 位點的分型 根據(jù)1.7 的篩查結(jié)果，對引物ACSL1-17-18 擴增片段的SNPs 進行全部樣品篩查，實驗雞群反應(yīng)體系與1.7 混池的擴增反應(yīng)體系相同。

PCR 擴增程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；55.3 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，36 個循環(huán)；72℃再延伸5 min；最后4℃保存，所有擴增反應(yīng)均在S1000TM Thermal Cycler PCR 儀中進行。

將擴增成功的樣品送至測序公司進行測序，根據(jù)PCR 產(chǎn)物的測序結(jié)果，利用DNAStar 軟件的SeqMAN程序進行序列和峰圖對比，并記錄好分型結(jié)果。

1.9 基因與基因型頻率的計算和哈代-溫伯格檢驗 使用下列公式計算SNP 位點的等位基因頻率：

其中，F(xiàn)i表示SNP 位點等位基因I 的頻率，Aii和Aij分別表示各個品種內(nèi)SNP 位點為純合（ii）和雜合（ij）的個體數(shù)，n 表示某個品種的個體數(shù)。哈代-溫伯格平衡檢驗采取卡方檢驗，使用Excel 軟件進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗群體基因組抽提結(jié)果 對500 只個體的血樣全部抽提DNA，所有DNA 經(jīng)Thermo 核酸儀檢驗，最終將條帶清晰明亮、質(zhì)量較好，濃度和純度均達到實驗要求的DNA 用于后續(xù)實驗。

2.2ACSL1基因SNPs 位點的篩選 初篩結(jié)果表明，第17～18 外顯子區(qū)域（1 295 bp）SNPs 位點較豐富，且測序結(jié)果較好，易于分型，故對這段區(qū)域進行全部樣品篩查。最終檢測到3 個SNP 突變位點（表3）。

表3 ACSL1 基因SNPs 突變位點

2.3ACSL1基因各位點的哈代-溫伯格平衡檢驗 對T32126C、C32013T、A31958G 這3 個位點進行分型，統(tǒng)計出這3 個SNPs 的基因型數(shù)量、等位基因頻率，并進行哈代-溫伯格平衡檢驗，結(jié)果如表4 所示，3 個SNPs 經(jīng)檢驗后的P值都大于0.05，因此其基因頻率符合哈代-溫伯格平衡，說明該實驗群體足夠大且滿足隨機交配，并未發(fā)生突變、選擇和遷移。

表4 各SNPs 的基因型數(shù)、等位基因頻率和哈代-溫伯格平衡檢驗

2.4ACSL1基因SNPs 位點與各性狀的相關(guān)性分析 表5結(jié)果顯示，A31958G 位點與各個性狀都不相關(guān)（P＞0.05），但GG 型群體的全凈膛重顯著高于AG 型群體，與AA型群體差異不顯著。

表5 ACSL1 基因A31958G 位點與各性狀關(guān)聯(lián)分析

表6 結(jié)果顯示，T32126C 位點與活體重顯著相關(guān)，且該位點TC 型群體的活體重顯著高于TT 型群體與CC型群體，而TT 型群體與CC 型群體則差異不顯著。

由表7 可知，C32013T 位點與腹脂重和腹脂率存在很強的相關(guān)性（P＜0.01），且該位點TT 型群體的腹脂重與腹脂率都極顯著低于TC 型群體與CC 型群體，而TC 型群體與CC 型群體差異不顯著。

3 討 論

本研究以雞ACSL1基因為研究對象，通過擴增其外顯子區(qū)域并對其多態(tài)性進行研究，最終在第17～18 外顯子區(qū)域（1 295 bp）檢測到了T32126C、C32013T、A31958G 3 個SNP 突變位點。目前ACSL1基因在有關(guān)家畜育種中的研究多為基因多態(tài)性的檢測[13]，且在雞上的研究不多。岳碧娥等[14]通過檢測和測序證實ACSL1基因存在的2 個SNP 位點，可作為朗德鵝分子遺傳標(biāo)記位點；本研究發(fā)現(xiàn)T32126C 突變位點對實驗群體的活體重有一定影響，C32013T 突變位點對實驗群體的腹脂重與腹脂率有顯著影響，而關(guān)于這2 個位點能否作為遺傳標(biāo)記對黃羽肉雞的活體重與腹脂進行選擇，仍有待進一步驗證。

表6 ACSL1 基因T32126C 位點與各性狀關(guān)聯(lián)分析

表7 ACSL1 基因C32013T 位點與各性狀關(guān)聯(lián)分析

Li 等[15]研究表明ACSL1可能與豬的脂肪沉積能力和肉質(zhì)有關(guān)。Widmann 等[16]研究表明ACSL1基因是牛骨骼肌脂肪酸組成的功能候選基因，且該基因可能在調(diào)節(jié)牛肉脂質(zhì)組成中起著重要作用。這些研究結(jié)果都表明，ACSL1基因在脂肪代謝中起重要作用，本實驗首次發(fā)現(xiàn)的C32013T 位點與腹脂重和腹脂率存在很強的相關(guān)性，能夠為選擇低脂的優(yōu)質(zhì)雞提供一定依據(jù)。曹陽[17]以綿羊ACSL1基因的序列信息為參考序列，對ACSL1基因多態(tài)性檢測結(jié)果表明，第2 外顯子的突變位點對部分脂肪酸及氨基酸含量有影響，而本研究首次發(fā)現(xiàn)的C32013T 位點位于ACSL1基因的第18 外顯子區(qū)域，為同義突變，并未造成氨基酸改變，該突變可能會改變mRNA 的剪切效率或準(zhǔn)確性導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生變化，進而影響個體性狀。

李慶崗等[18]研究發(fā)現(xiàn)ACSL1基因的T 等位基因為該大白豬的優(yōu)勢基因，將TT 型個體留作種用能顯著減少豬的背膘厚度。本研究發(fā)現(xiàn)C32013T 位點中，TT型群體的腹脂重與腹脂率都極顯著低于TC 型群體與CC 型群體，而TC 型群體與CC 型群體差異不顯著，故將TT 型個體留作種用可能有助于減少黃羽肉雞的腹脂含量；T32126C 位點則與實驗群體的活體重呈顯著相關(guān)，且該位點TT 型群體與CC 型群體的活體重均顯著高于TC 型群體，但TT 型群體與CC 型群體差異不顯著，故將TT 型群體與CC 型群體留作種用可能會利于黃羽肉雞的增重。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，黃羽肉雞ACSL1基因第17～18 外顯子區(qū)域（1 295bp）SNPs 位點較豐富，T32126C、C32013T、A31958G 這3 個位點的等位基因頻率符合哈代-溫伯格平衡，且A31958G 突變位點、T32126C 突變位點與腹脂重、腹脂率不相關(guān)，C32013T 突變位點對雞的腹脂重與腹脂率有顯著影響。故可以嘗試?yán)肅32013T 突變位點對黃羽肉雞腹脂重進行分子標(biāo)記輔助選擇。另外，雞ACSL1基因T32126C 突變位點對活體重有顯著影響，故該位點也能夠嘗試作為分子標(biāo)記用于優(yōu)質(zhì)雞的活體重選擇。