李菲，李喆，胡文進(jìn)，黃庶識(shí)，劉涇涇，黃媛林，王巧貞，潘信利*

(1.廣西科學(xué)院 廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2.廣西科學(xué)院 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；3.廣西科學(xué)院 國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心/非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西生物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530007；4.北京理工大學(xué) 材料學(xué)院，北京 100081)

1 引言

工業(yè)生物催化是以酶應(yīng)用為核心，其具有位點(diǎn)和立體專一性的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)基因克隆、突變和雜交等手段，用易錯(cuò)PCR 方法構(gòu)建突變庫(kù)，結(jié)合高通量篩選策略來(lái)提高酶的活性、穩(wěn)定性、立體選擇性和非水反應(yīng)性能[1]。鑒于生物催化的顯著優(yōu)勢(shì)，廣大學(xué)者和研發(fā)人員對(duì)各種生物功能酶展開(kāi)深入研究。如黑曲霉Aspergillus niger963 的植酸酶基因，重組至畢赤酵母中表達(dá)，其植酸降解產(chǎn)量較原黑曲霉提高3 000 倍以上[2]；諾卡氏菌Nocardiasp.YS?2002 發(fā)酵腈水合酶活力最高達(dá)6 000 國(guó)際單位，并在大腸桿菌和畢赤酵母中獲得表達(dá)[3]。深海熱液口嗜熱厭氧古細(xì)菌熱球菌屬Thermococcussp.HJ21 產(chǎn)胞外耐熱酸性α-淀粉酶，最適溫度高達(dá)95℃[4]；肇東市日成酶制劑公司黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶，其酶活力可達(dá)20 000 U/mL，高于目前生產(chǎn)菌株的25 倍，在真菌基因工程菌中處于領(lǐng)先地位[5]。然而，隨著功能酶制品行業(yè)的迅速發(fā)展，進(jìn)而顯露出不少弊端，主要體現(xiàn)在以下3 個(gè)方面[1]：（1）酶的種類單一，由多種原酶組成的多功能復(fù)合酶制劑發(fā)展滯后，難以滿足市場(chǎng)的需要；（2）酶活力低，產(chǎn)品的提取工藝和設(shè)備水平相對(duì)落后，導(dǎo)致一些產(chǎn)品的性價(jià)比低，缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力；（3）酶制劑生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的“三廢”會(huì)造成環(huán)境污染問(wèn)題。因此，尋找高產(chǎn)多種功能酶的菌種資源成為解決這一瓶頸的重要方法，并能有效地推動(dòng)我國(guó)酶制劑工業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

紅樹(shù)林作為獨(dú)特的潮間帶生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)保護(hù)熱帶和亞熱帶的海岸線至關(guān)重要[6]。紅樹(shù)林系統(tǒng)常年受到海水周期性浸淹、波浪、強(qiáng)風(fēng)、強(qiáng)流、徑流、沉積物、污水及廢水等因素的影響，形成了復(fù)雜的組成成分，加快了能量和物質(zhì)循環(huán)速度，增強(qiáng)了生產(chǎn)力和有機(jī)質(zhì)的降解活性。然而，微生物作為紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)中種類豐富、數(shù)量龐大的組成部分，在碳固定、碳分解、氮固定和硫代謝等物質(zhì)和能量循環(huán)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[7]。此外，紅樹(shù)林微生物長(zhǎng)期生活在高溫、高鹽、強(qiáng)風(fēng)、缺氧和強(qiáng)紫外線等劣勢(shì)環(huán)境中，其遺傳物質(zhì)隨之不斷適應(yīng)和進(jìn)化[8]，代謝出結(jié)構(gòu)新穎、種類豐富、活性多樣的化合物[9]。研究發(fā)現(xiàn)，紅樹(shù)林微生物的代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓、抗氧化、細(xì)胞毒和殺蟲(chóng)等生物活性[10-12]，且富含淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶等多種功能酶及抗生素類化合物[13-16]。廣西茅尾海紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)內(nèi)為熱帶過(guò)渡海洋性季風(fēng)氣候，海陸交會(huì)使物質(zhì)積累豐富，蘊(yùn)育著龐大的生物類群。針對(duì)這一特殊生境，本研究選取該保護(hù)區(qū)內(nèi)的土壤作為研究對(duì)象，通過(guò)8 種分離培養(yǎng)基、分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，獲得紅樹(shù)林土壤中可培養(yǎng)放線菌的多樣性信息。采用點(diǎn)植法和透明圈法，以期獲得具有高產(chǎn)多種功能酶活性的菌株，為從海洋環(huán)境中尋找新的微生物資源提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 紅樹(shù)林土壤樣本

2018 年8 月從廣西茅尾海紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)（21°44′53′′N，108°36′14′′E）中采集了3 處土壤樣本（每處相距5 m，由近岸紅樹(shù)林往外采集）。樣品裝于密封袋，4℃低溫保藏備用。

2.1.2 培養(yǎng)基

1）分離培養(yǎng)基

AGG、M7、P7、M10、M4、M5、M9 和P3（表1）。

2）純化培養(yǎng)基

改良ISP2 固體培養(yǎng)基[17]。

3）酶活篩選培養(yǎng)基

脲酶篩選培養(yǎng)基：尿素20.0 g，胰蛋白胨1.0 g，葡萄糖1.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO42.0 g，酚紅0.012 g，瓊脂15.0 g，去離子水1 000 mL。酯酶篩選培養(yǎng)基：吐溫20 或吐溫80 10 mL，胰蛋白胨1.0 g，瓊脂15.0 g，去離子水1 000 mL。過(guò)氧化氫酶和氧化酶活性篩選培養(yǎng)基以改良ISP2 固體培養(yǎng)基為載體。纖維素酶[18]、蛋白酶、淀粉酶[19]、幾丁質(zhì)酶[20]和褐藻膠裂解酶[21]篩選培養(yǎng)基參考了對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)配制。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 菌株的分離純化

將土壤平鋪于無(wú)菌平皿中，經(jīng)65 ℃熱風(fēng)干燥30 min。稱取2.0 g 樣品裝于20 mL 無(wú)菌水中搖勻；制成10?2和10?3稀釋度的樣液，取200 μL 梯度稀釋的樣液接種于8 種復(fù)合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)數(shù)天，及時(shí)觀察菌株的生長(zhǎng)情況，挑取肉眼可見(jiàn)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，記錄其形態(tài)特征和菌落數(shù)，以30%（V/V）甘油?ISP2 混合液作為保護(hù)劑，將純化好的菌株制成凍存管于?70℃條件下以保藏。

表1 分離培養(yǎng)基配方Table 1 Recipe of media for actinomycetes isolation

2.2.2 16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用chelex?100 樹(shù)脂[22]快速提取細(xì)菌的DNA 作為PCR 模板，并根據(jù)Walsh 等[23]的方法對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增和測(cè)序引物選用27F 和1522R，參照李菲等[24]的方法設(shè)定PCR 反應(yīng)條件。其中，潛在新菌株的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶用試劑盒進(jìn)行切膠回收，將純化好的DNA 連接到pEASY?T1 克隆載體上，轉(zhuǎn)化至Trans?T1 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐西林的LB 固體培養(yǎng)基(蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂14.0 g，去離子水1 L)，培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落情況，挑取陽(yáng)性克隆子，用PCR 法驗(yàn)證克隆的片段大小。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖?TAE 凝膠電泳檢測(cè)合格后，委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor 軟件整理后，利 用EzBioCloud 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.ezbiocloud.net/）進(jìn)行在線比對(duì)[25]；以同源性最高菌株的有效序列作為參比對(duì)象，構(gòu)建Neighbor?Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，各分支置信值設(shè)為Boostrap 1 000 次，對(duì)各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析[26]。

2.2.3 放線菌的酶活性檢測(cè)

運(yùn)用點(diǎn)植法將待測(cè)放線菌接種于酶活篩選培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)1～7 d。用透明圈法初步測(cè)定酯酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和褐藻膠裂解酶活性，觀察培養(yǎng)基上菌苔產(chǎn)生透明圈的情況；脲酶活性篩選則是觀察培養(yǎng)基變色情況，培養(yǎng)基變桃紅色則為陽(yáng)性，反之則不變色。過(guò)氧化氫酶活性篩選是將5%的過(guò)氧化氫溶液滴加至每個(gè)菌苔，觀察菌苔產(chǎn)氣泡的情況，若產(chǎn)氣泡，則判定菌株具有過(guò)氧化氫酶活性。氧化酶活性篩選是將2%N,N-二甲基對(duì)苯二胺二鹽酸鹽溶液滴加至每個(gè)菌苔，觀察菌苔變色情況，若菌苔在30 s 內(nèi)變成紫紅色則判定菌株含有氧化酶活性，反之則無(wú)。

3 結(jié)果與分析

3.1 紅樹(shù)林土壤放線菌的多樣性

廣西茅尾海紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)內(nèi)紅樹(shù)林土壤中共分離到444 株放線菌，通過(guò)形態(tài)、大小和顏色等形態(tài)學(xué)特征去除部分冗余菌株，得到97 株放線菌進(jìn)一步開(kāi)展16S rRNA 基因測(cè)序分析，結(jié)果獲得63 種放線菌，隸屬于6 目13 科24 屬（圖1，表2）。鏈霉菌屬為優(yōu)勢(shì)類群，即菌種數(shù)為14，占所獲菌種數(shù)的22.22%；其他均屬為稀有放線菌，共49 種，占所獲菌種數(shù)的77.78%，其中微桿菌屬有8 種，占12.70%。

根據(jù)放線菌16S rRNA 基因序列相似性小于98.65%的菌株屬于不同物種的歸類原則[27]，對(duì)紅樹(shù)林土壤中分離到的放線菌進(jìn)行新穎性分析，3 株放線菌的16S rRNA 基因序列（約1 500 bp）與其最近緣的典型菌株序列相似性均低于98.5%。其中，菌株Y1190 與微桿菌科的有效發(fā)表種Agromyces italicusDSM 16 388T(AT XF01000012)，B2965 和 Y1290 分別與諾卡氏菌科的有效發(fā)表種Gordonia oryzaeRS15-1ST(RKMH01000030)和Gordonia sediminisAMA 120T(MH013353)相似性最高，其相似率分別為97.42%、98.02%和98.35%?；?6S rRNA 基因序列，3 株潛在新種與其所在菌科中鄰近菌株構(gòu)建的Neighbor?Joining、Maximum?Likelihood和Maximum?Parsimony 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，均能與其相似菌株在進(jìn)化樹(shù)上聚為一簇。由此推測(cè)，菌株Y1190、B2965 和Y1290 可能分別為微桿菌科和諾卡氏菌科中的潛在新分類單元。需要進(jìn)一步展開(kāi)多相分類學(xué)鑒定工作，以確定菌株Y1190、B2965 和Y1290 的分類地位。

3.2 不同分離培養(yǎng)基的種屬分析

采用8 種分離培養(yǎng)基，從紅樹(shù)林土壤中共分離到63 種放線菌，分離效果見(jiàn)圖2 和表3。結(jié)果顯示，以菌屬數(shù)為主，培養(yǎng)基的分離效果從優(yōu)到次排序?yàn)镻3、P7=M10、M4、M5=M7、AGG、M9；以菌種數(shù)為主，排序?yàn)镻3、M10、P7、M4、M5、M7、AGG=M9；以菌株數(shù)為主，排序?yàn)镸5、M10、P3、M4=P7、AGG、M7、M9。綜合3 個(gè)數(shù)值分析，P3、M10 和P7 培養(yǎng)基的分離效果顯著，分離到的放線菌種類和數(shù)量均較為豐富；其中，短桿菌屬、纖維微菌屬、假節(jié)桿菌屬和四折疊球菌屬類群僅在P3 培養(yǎng)基中獲得。結(jié)合多樣性指數(shù)分析（表3），P3 培養(yǎng)基分離的放線菌多樣性最好，其次是P7、M10、M4 和M7 培養(yǎng)基，M5、M9 和AGG 培養(yǎng)基的分離效果較差。P3 培養(yǎng)基主要以粗燕麥作為能源物質(zhì)，富含有各種維生素、微量元素和纖維等物質(zhì)，但水溶性較差，屬于寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。此外，本研究發(fā)現(xiàn)燕麥、甘油和海藻糖可作為分離紅樹(shù)林生境的理想碳源；脯氨酸、天門(mén)冬氨酸和水解酪素為理想氮源。

3.3 放線菌的酶活性篩選結(jié)果

圖1 紅樹(shù)林土壤放線菌的16S rRNA 基因序列Neighbor?Joining 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic analysis of actinomycetes from mangrove soil based on 16S rRNA sequences

表2 紅樹(shù)林土壤放線菌的分布Table 2 Distribution of actinomycetes from mangrove soil

圖2 不同培養(yǎng)基分離到放線菌的種類數(shù)量Fig.2 Quantities of species isolated from different media

表3 不同培養(yǎng)基分離到的細(xì)菌多樣性Table 3 Bacterial diversity isolated from different media

圖3 部分放線菌的酶活檢測(cè)效果圖Fig.3 Renderings of enzyme activity in some actinomycete

圖4 56 株放線菌的酶活篩選結(jié)果Fig.4 Enzyme-producing activities of 56 actinomycetes

以尿素、吐溫20、吐溫80、羧甲基纖維素鈉、膠體幾丁質(zhì)、可溶性淀粉和脫脂奶粉等原料作為篩選底物，對(duì)63 株不同種的放線菌進(jìn)行功能酶活性篩選（圖3，圖4）。結(jié)果表明，從所測(cè)菌株中篩選到56 株放線菌在至少1 種功能酶活性檢測(cè)中顯示陽(yáng)性，總陽(yáng)性率為88.89%；篩選到具有2 種以上酶活性的放線菌為31 株，總陽(yáng)性率為49.21%。表4 所示，產(chǎn)脲酶、酯酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、蛋白酶、氧化酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶和褐藻膠裂解酶活性的放線菌數(shù)分別為12 株、25 株、36 株、17 株、24 株、2 株、4 株、5 株和5 株，陽(yáng)性率分別為19.05%、39.68%、41.27%、26.98%、38.10%、3.17%、6.35%、7.94%和7.94%。

4 結(jié)論與討論

放線菌是一種最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生物技術(shù)價(jià)值的原核生物，是產(chǎn)生抗生素、酶及其抑制劑等功能活性物質(zhì)的主要來(lái)源。據(jù)報(bào)道，截至2002 年，已知的微生物活性次生代謝產(chǎn)物超過(guò)22 000 種，其中70%來(lái)自放線菌，20%來(lái)自真菌，7%由芽孢桿菌產(chǎn)生，1%～2%來(lái)源于其他細(xì)菌[28]。其中，放線菌因其豐富的生物化學(xué)多樣性、可大規(guī)模培養(yǎng)及易于遺傳操作等優(yōu)點(diǎn)，日益成為生產(chǎn)生物活性化合物和工業(yè)酶的重要資源[28]。據(jù)報(bào)道，來(lái)源于海洋的放線菌含有豐富的功能酶，紅樹(shù)林作為海洋特殊的生態(tài)系統(tǒng)，其放線菌在功能酶上的研究卻寥寥無(wú)幾[18,29-31]。本研究選取廣西茅尾海紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的紅樹(shù)林土壤作為研究對(duì)象，開(kāi)展可培養(yǎng)放線菌多樣性分析，從中分離到可培養(yǎng)放線菌444 株，隸屬于6 目13 科24 屬63 種，分離到放線菌的優(yōu)勢(shì)菌群為鏈霉菌屬（22.22%）和微桿菌屬（12.70%），與各地紅樹(shù)林土壤中放線菌優(yōu)勢(shì)菌群的報(bào)道不盡相同，如馬來(lái)西亞熱帶紅樹(shù)林土壤中的鏈霉菌屬占59.80%[32]；印度洋紅樹(shù)林土壤中的鏈霉菌屬和馬杜拉菌屬分別占32.37% 和15.11%[31]；九龍江口紅樹(shù)林放線菌中的小單胞菌屬和鏈霉菌屬分別占81.38%和13.20%[33]；巴西紅樹(shù)林土壤中放線菌以微桿菌屬為主[34]；海南?？诒备蹗u紅樹(shù)林土壤放線菌主要以脫醌菌屬和微球菌屬為主[35]；海南三亞紅樹(shù)林底泥中放線菌以小單胞菌屬為主[36]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，紅樹(shù)林土壤中存在動(dòng)球菌屬、四折疊球菌屬、短狀桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、科氏游動(dòng)菌屬和Mycolicibacteriumsp.等放線菌類群，該部分放線菌僅在鹽湖、高鹽咸水灘和鹽場(chǎng)等高鹽環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)[37-38]?？梢?jiàn)，紅樹(shù)林生境中富含耐鹽的放線菌類群。

表4 56 株放線菌的功能酶活性Table 4 Enzyme-producing activities of 56 actinomycetes

酶活檢測(cè)結(jié)果顯示，這一批紅樹(shù)林土壤放線菌中具有豐富的酶活特性且部分菌株的酶活特性顯著。研究發(fā)現(xiàn)，紅樹(shù)林土壤中酶活代謝活力最強(qiáng)的類群為鏈霉菌屬，其次是微桿菌屬和短小桿菌屬，這與大部分的研究報(bào)道結(jié)果相似[19,34,39]。其中，產(chǎn)酯酶、過(guò)氧化氫酶和蛋白酶的放線菌數(shù)較高，這可能與紅樹(shù)林土壤富含動(dòng)植物殘?bào)w所提供的脂素和蛋白類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。此外，紅樹(shù)林生境中有機(jī)質(zhì)較非紅樹(shù)林區(qū)域的豐富[40]，致使其生境放線菌具有多種功能酶活性，但本文研究結(jié)果顯示，具有2 種以上酶活功能的放線菌有31 株，僅占50%左右，且3 種以上酶活功能的菌株數(shù)更少了。究其原因可能是：（1）人工配置培養(yǎng)基的底物具有一定篩選作用；（2）紅樹(shù)林土壤受到海水周期性浸淹，海水中動(dòng)植物殘?bào)w及紅樹(shù)植物代謝產(chǎn)生豐富有機(jī)質(zhì)，放線菌通過(guò)分解這些有機(jī)質(zhì)來(lái)生存；（3）紅樹(shù)林放線菌的生境特殊，其需具備多種功能酶特性，以便利用復(fù)雜多變的生境中微量的有機(jī)質(zhì)進(jìn)行生存。后續(xù)將用活性追蹤對(duì)這56 株放線菌的功能酶進(jìn)行分離、檢驗(yàn)和分析，進(jìn)一步確定其具體的作用機(jī)制。綜上所述，廣西茅尾海紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)的放線菌資源豐富，在酶制劑應(yīng)用方面具有較強(qiáng)的開(kāi)發(fā)潛力，為后續(xù)篩選農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物提供了依據(jù)。