梁鑫，張成楠*，周威，李秀婷，4，萬澄瑩

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京100048；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京100048；3.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京100048；4.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京100048）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一類絲氨酸水解酶，能夠催化酯鍵斷裂和形成，參與轉(zhuǎn)酯、酯化和酯交換等多種反應(yīng)。在食品工業(yè)中，脂肪酶因其催化效率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于酯類化合物合成、油脂改性、以及酒和其它飲料的風(fēng)味改善等領(lǐng)域[1-4]。游離脂肪酶的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性差、成本高、且無法循環(huán)利用，利用物理或化學(xué)方法將游離酶結(jié)合到惰性載體上轉(zhuǎn)變成固定化酶，可以有效改善酶的穩(wěn)定性，提高酶的催化壽命和回收率等，并可降低成本，擴(kuò)大其工業(yè)應(yīng)用范圍[5-6]。然而，尋找適合于脂肪酶的生物相容性載體和合適的固定化方法，在保護(hù)酶不失活且可重復(fù)回收利用的同時(shí)，還能最大程度上保證酶的催化活性，卻一直是個(gè)挑戰(zhàn)。

近年來，新型功能多孔材料的研究方興未艾，由于金屬有機(jī)框架（metal-organic frameworks，MOFs）多孔結(jié)構(gòu)材料具有比表面積大、孔隙率高、孔道可調(diào)控性、易功能化及易修飾性等獨(dú)特的性能優(yōu)勢(shì)受到了廣泛的關(guān)注，利用MOFs 材料制備固定化酶已成為研究熱點(diǎn)[7]?；贛OFs 材料，研究者通常采用表面吸附法、共價(jià)交聯(lián)法、孔隙封裝法和原位自封裝法（也稱原位封裝法）4 種手段制備固定化脂肪酶[8-9]。表面吸附法和共價(jià)交聯(lián)法主要通過氫鍵、共價(jià)鍵等將酶分子固定于MOFs 載體表面，這兩種方法存在酶分子易于脫落，機(jī)械穩(wěn)定性差或者酶的構(gòu)象改變?cè)斐擅富盍档偷葐栴}?？紫斗庋b法和原位自封裝法是將酶分子封閉在MOFs 內(nèi)部，給酶分子“穿上”MOFs“盔甲”，借助MOFs材料的剛性框架，有效地提升酶的穩(wěn)定性，兩種方法的不同之處在于，孔隙封裝法通過直接將脂肪酶分子與已合成的MOFs 載體混合，使脂肪酶分子穿過MOFs孔道進(jìn)入載體內(nèi)部制備固定化酶；原位自封裝法是通過將酶分子加入MOFs 載體合成的反應(yīng)液中，在自組裝形成載體的同時(shí)，直接把酶分子封閉到了MOFs 內(nèi)部[8-9]。研究表明，在穿過MOFs 表面孔道被包裹進(jìn)載體內(nèi)部的過程中，酶分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生不可逆的“展開”，導(dǎo)致其變性失活[10]。因此，更多的研究者將目光聚焦于使用原位自封裝法制備MOFs 固定化脂肪酶。目前，研究人員利用不同MOFs 材料原位封裝不同來源的脂肪酶成功制備了十余種固定化脂肪酶[11-17]。

研究發(fā)現(xiàn)，利用原位自封裝法制備的固定化酶的形貌和活性受到多種因素的影響，如金屬離子和有機(jī)連接體的濃度、酶的濃度等[9]。沸石-咪唑框架-8（zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8）是以Zn2+和咪唑連接體通過配位鍵自組裝形成的一種MOFs 材料[7]。Cui 等[18]研究發(fā)現(xiàn)通過改變硝酸鋅和2-甲基咪唑的濃度和比例可以使ZIF-8 構(gòu)象由菱形十二面體形狀改變成十字花形狀，利用十字花形狀的ZIF-8 原位封裝過氧化氫酶制備的固定化酶的活性比菱形十二面體形狀的固定化酶提高了400%。Pitzalis 等[16]研究了硝酸鋅和2-甲基咪唑摩爾比（Zn/M）不同對(duì)固定化脂肪酶的影響，結(jié)果表明，在Zn/M=1∶4 條件下制備的固定化脂肪酶比在Zn/M=1∶40 條件下制備的固定化脂肪酶具有更高的負(fù)載量和比活性。Qi 等[13]研究發(fā)現(xiàn)原位自封裝法制備的固定化脂肪酶的水解效率隨酶濃度增加而提高，然而負(fù)載率隨酶濃度增加而下降。對(duì)于固定化載體MOFs 材料，金屬離子的來源、反應(yīng)時(shí)間等因素都會(huì)影響其形貌[19]，然而這些因素對(duì)固定化脂肪酶影響的研究相對(duì)較少。

本研究采用ZIF-8 材料原位自封裝皺褶假絲酵母源脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL）制備固定化脂肪酶（CRL@ZIF-8），探討了金屬離子來源、反應(yīng)時(shí)間、金屬離子濃度和有機(jī)連接體的濃度等因素對(duì)固定化酶催化活性和形貌特征的影響，并比較了游離酶與固定化酶的溫度耐受性。

1 材料與方法

1.1 材料

皺褶假絲酵母脂肪酶（CRL）、硝酸鋅、2-甲基咪唑、醋酸鋅、對(duì)硝基苯丁酸酯（p-nitrophenylbutyrate，PNPB）：美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；正庚烷；美國(guó)Meridian Medical Technologies 公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

Himac 多用途冷凍離心機(jī)（CF-RN 系列）、掃描電子顯微鏡（SU8010）：日本Hitachi Koki 公司；高速組織勻漿機(jī)（T 10 basic）：德國(guó)IKA 公司；真空冷凍干燥機(jī)（Free zone 4.5 plus）：美國(guó)Labconco 公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet IS50）：賽默飛世爾科技有限公司；桌面型多晶X 射線衍射儀（D2 PHASER）：德國(guó)布魯克AXS 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪酶的固定化

參考Cui 等[18]關(guān)于固定化過氧化氫酶的制備方法并做適當(dāng)修改。將20 mL 1 mol/L 2-甲基咪唑溶液與80 mg CRL 混合均勻，然后加入2 mL 0.5 mol/L 醋酸鋅溶液，在300 r/min 下反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水洗滌沉淀物3 次，收集沉淀，冷凍干燥（-80 ℃，12 h），得到固定化脂肪酶CRL@ZIF-8。以在相同條件下不添加酶制備的ZIF-8 作為空白對(duì)照。

1.3.2 固定化脂肪酶CRL@ZIF-8 酶活力的測(cè)定

固定化脂肪酶的酶活測(cè)定方法參考QIL 等的方法并做適當(dāng)修改[13]。稱取0.01 g CRL@ZIF-8，加入1 mL 0.01 mol/L 的溶于正庚烷中的PNPB 溶液和1 mL 0.01 mol/L（pH 7.5）的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），在13 000 r/min 均質(zhì)30 s，再在200 r/min條件下振蕩反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，4 ℃下離心收集上清液，在405 nm下測(cè)定吸光值。一個(gè)酶活力單位定義為：每分鐘釋放1 μmol 對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）所需的固定化酶的酶量，以U/g 表示。

1.3.3 固定化脂肪酶CRL@ZIF-8 結(jié)構(gòu)表征

稱取一定量的CRL@ZIF-8 樣品，研磨至均勻粉末，使用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析結(jié)構(gòu)組成，掃描范圍為400 cm-1～4 000 cm-1；使用X-射線衍射（Xray diffraction，XRD）分析晶體結(jié)構(gòu)，掃描的角度范圍為5°～45°，掃描時(shí)間為0.07 s；采用掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）分析樣品形貌。

1.3.4 脂肪酶固定化條件的選擇

采用1.3.1 脂肪酶CRL 的固定化方法，分別考察金屬離子來源、反應(yīng)時(shí)間、金屬離子和有機(jī)連接體的濃度對(duì)CRL@ZIF-8 形貌結(jié)構(gòu)和催化活性的影響，并以固定化酶酶活力為指標(biāo)，篩選最佳的固定化條件。

1.3.5 固定化脂肪酶CRL@ZIF-8 的溫度耐受性研究

稱取一定量的CRL@ZIF-8，加入0.01 mol/L 的PBS 緩沖液中，在50 ℃下水浴振蕩，分別在0、10、20、30、45、60 min 測(cè)定酶活力。設(shè)置0 min 的酶活力為100%，分別計(jì)算在不同時(shí)間固定化酶的剩余酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶固定化條件的選擇

2.1.1 不同金屬鹽對(duì)CRL@ZIF-8 的結(jié)構(gòu)和催化活性的影響

ZIF-8 由Zn2+和咪唑基連接體自組裝合成，目前文獻(xiàn)中報(bào)道的用于合成固定化脂肪酶CRL@ZIF-8 的Zn2+供體主要包括硝酸鋅和醋酸鋅等[11-17]，然而不同Zn2+供體對(duì)固定化脂肪酶的影響尚不清楚。本研究考察了利用相同濃度的硝酸鋅或醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 的差異，結(jié)果如圖1、圖2 和圖3 所示。圖1為利用硝酸鋅或醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 和CRL 的FT-IR 譜圖。

由圖1a 可見，CRL@ZIF-8（硝酸鋅）和CRL@ZIF-8（醋酸鋅）均在420 cm-1處出現(xiàn)ZIF-8 的Zn-N 鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，在692 cm-1和758 cm-1處出現(xiàn)咪唑環(huán)的平面外彎曲特異吸收峰，在953 cm-1和1 308 cm-1處出現(xiàn)咪唑環(huán)的平面內(nèi)彎曲特異吸收峰，在2 930 cm-1和3 124 cm-1處出現(xiàn)咪唑的脂肪族和芳香族的C-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，這些特異吸收峰與文獻(xiàn)中報(bào)道的ZIF-8 的特異吸收峰一致[12-13]；CRL@ZIF-8（硝酸鋅）、CRL@ZIF-8（醋酸鋅）和CRL 均在1 600 cm-1～1 700 cm-1處出現(xiàn)蛋白質(zhì)的酰胺鍵的特異吸收峰，將1 500 cm-1～2 000 cm-1位置局部放大，由圖1b 可見，CRL@ZIF-8（硝酸鋅）和CRL@ZIF-8（醋酸鋅）的酰胺鍵的特異吸收峰相比于CRL 出現(xiàn)了輕微的偏移，這可能是因?yàn)閆IF-8 結(jié)構(gòu)中的Zn2+與脂肪酶分子中的羰基間的相互作用引起酰胺鍵的特異吸收峰發(fā)生變化[13]。上述研究結(jié)果從官能團(tuán)方面表明成功制備出了CRL@ZIF-8。

圖2 為利用硝酸鋅或醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8的XRD 譜圖。

圖1 不同金屬鹽制備的CRL@ZIF-8 的FT-IR 圖Fig.1 FTIR spectra of CRL@ZIF-8 synthesized by employing different zinc salt

圖2 不同金屬鹽制備的CRL@ZIF-8 的XRD 圖Fig.2 XRD patterns of CRL@ZIF-8 synthesized by employing different zinc salt

由圖2 可見，CRL@ZIF-8（醋酸鋅）在2θ=7.29°、10.31°、12.66°、14.64°、16.41°、17.99°、22.08°、24.43°、25.54°、26.63°、29.61°、30.56°的位置觀察到衍射峰，與ZIF-8 的標(biāo)準(zhǔn)XRD 譜圖基本一致[13，15]。CRL@ZIF-8（醋酸鋅）與ZIF-8 衍射峰分布規(guī)律一致，表明固定化脂肪酶CRL 對(duì)ZIF-8 的晶體結(jié)構(gòu)沒有顯著的影響。相比較于CRL@ZIF-8（醋酸鋅）和標(biāo)準(zhǔn)的ZIF-8 結(jié)構(gòu)，CRL@ZIF-8（硝酸鋅）的衍射峰分布規(guī)律顯著不同。Biemmi 等[19]研究表明，利用硝酸鋅合成的MOF-5 晶粒較大，而利用醋酸鋅合成的MOF-5 晶粒較小。這可能是由于與硝酸鋅相比，醋酸鋅的堿性更強(qiáng)。相比于以硝酸鋅作為Zn2+供體，以醋酸鋅作為Zn2+供體合成MOF 過程中的初始成核率更高[19]。

圖3 為利用硝酸鋅或醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8的酶活力。

圖3 不同金屬鹽制備的CRL@ZIF-8 的酶活Fig.3 The enzymatic activity of CRL@ZIF-8 synthesized by employing different zinc salt

固定化脂肪酶催化對(duì)硝基苯丁酸酯（PNBP）水解產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚（p-NP），對(duì)硝基苯酚在405 nm 處有紫外吸收，因此可通過吸光值的變化來測(cè)定固定化脂肪酶的酶活[20]。

由圖3 可見，CRL@ZIF-8（硝酸鋅）比CRL@ZIF-8（醋酸鋅）催化對(duì)硝基苯丁酸酯（PNPB）水解的能力更強(qiáng)。然而，通過對(duì)利用硝酸鋅或醋酸鋅制備的ZIF-8 研究發(fā)現(xiàn)，ZIF-8 也具有一定的催化PNPB 水解的能力，并且ZIF-8（硝酸鋅）比ZIF-8（醋酸鋅）催化PNPB 水解的能力更強(qiáng)，其原因有待探討。除去ZIF-8 催化PNPB 的水解作用，可以觀察到由醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 催化底物水解的活性強(qiáng)于由硝酸鋅制備的CRL@ZIF-8。綜上所述，選擇醋酸鋅進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)CRL@ZIF-8 的結(jié)構(gòu)和催化活性的影響

基于ZIF-8 材料利用原位自封裝法合成固定化酶的反應(yīng)時(shí)間對(duì)催化性能有重要影響[11-17]。本研究考察了ZIF-8 原位封裝CRL 制備固定化酶CRL@ZIF-8 的反應(yīng)時(shí)間對(duì)其結(jié)構(gòu)和催化活性的影響，結(jié)果如圖4、圖5 和圖6 所示。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間制備的CRL@ZIF-8 的FT-IR 圖Fig.4 FTIR spectra of CRL@ZIF-8 synthesized at different reaction times

由圖4 可見，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從10 min 增加到30 min時(shí)，CRL@ZIF-8 在420、692、758、953、1 308、1 651、2 930、3 124 cm-1處出現(xiàn)的特異吸收峰沒有顯著差異，從官能團(tuán)方面表明反應(yīng)時(shí)間對(duì)CRL@ZIF-8 的結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間制備的CRL@ZIF-8 的XRD 圖Fig.5 XRD patterns of CRL@ZIF-8 synthesized at different reaction times

由圖5 可見，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從10 min 增加到30 min時(shí)，CRL@ZIF-8 的衍射峰分布規(guī)律一致，表明反應(yīng)時(shí)間對(duì)CRL@ZIF-8 的晶體結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。

圖6 不同反應(yīng)時(shí)間制備的CRL@ZIF-8 的酶活Fig.6 The enzymatic activity of CRL@ZIF-8 synthesized at different reaction times

由圖6 可見，隨著反應(yīng)時(shí)間逐漸增加，CRL@ZIF-8 的酶活力逐漸提高，ZIF-8 原位封裝CRL 30 min 制備的固定化酶的酶活力比反應(yīng)10 min 制備的固定化酶的酶活力提高了260%。這可能是由于隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，ZIF-8 載體的固載率上升。Biemmi 等[19]研究表明，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，HKUST-1 的產(chǎn)率逐漸增加，而其晶體結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。反應(yīng)時(shí)間超過30 min 對(duì)CRL@ZIF-8 酶活力的影響有待于進(jìn)一步的研究探討。

2.1.3 2-甲基咪唑濃度對(duì)CRL@ZIF-8 的形貌結(jié)構(gòu)和催化活性的影響

2-甲基咪唑濃度影響到ZIF-8 的形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變ZIF-8 的比表面積[20]。本研究考察了利用不同濃度的2-甲基咪唑制備的CRL@ZIF-8 的差異，結(jié)果如圖7、圖8、圖9 和圖10 所示。

圖7 不同2-甲基咪唑濃度制備的CRL@ZIF-8 的FT-IR 圖Fig.7 FTIR spectra of CRL@ZIF-8 synthesized by using different 2-methylimidazole concentrations

FT-IR 分析表明，隨著2-甲基咪唑濃度的逐漸增加，ZIF-8 的特異吸收峰無顯著差異，而1 600 cm-1～1 700 cm-1處出現(xiàn)蛋白質(zhì)的酰胺鍵的特異吸收峰逐漸減弱（圖7）。XRD 分析表明，CRL@ZIF-8 的衍射峰強(qiáng)度隨著2-甲基咪唑濃度的增加逐漸增強(qiáng)（圖8）。SEM分析表明，當(dāng)2-甲基咪唑濃度為0.6 mol/L 時(shí)，大多數(shù)的CRL@ZIF-8 聚集成團(tuán)，晶體形狀不規(guī)則；隨著2-甲基咪唑濃度逐漸增加，CRL@ZIF-8 逐漸分散，且形狀越來越規(guī)則，結(jié)塊現(xiàn)象消失；當(dāng)2-甲基咪唑濃度為1.0 mol/L 時(shí)，CRL@ZIF-8 分散均勻，呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的菱形十二面體的形態(tài)（圖9）。這些研究結(jié)果表明，2-甲基咪唑濃度對(duì)CRL@ZIF-8 的形貌結(jié)構(gòu)具有顯著影響。Cui等[18]研究發(fā)現(xiàn)，通過改變2-甲基咪唑的濃度，ZIF-8 原位封裝過氧化氫酶制備的固定化酶catalase@ZIF 的形貌發(fā)生改變，從標(biāo)準(zhǔn)的菱形十二面體的形態(tài)改變?yōu)槭只ㄐ螒B(tài)。Qi 等[13]研究表明，在ZIF-8 原位封裝酶分子制備固定化酶的過程中，ZIF-8 材料并不是簡(jiǎn)單地將酶分子“包裹住”，相反，ZIF-8 材料與酶分子間發(fā)生了復(fù)雜的相互作用。本研究中未發(fā)現(xiàn)相似的形態(tài)改變現(xiàn)象，可能是因?yàn)橹久窩RL 與過氧化氫酶的結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的。

圖8 不同2-甲基咪唑濃度制備的CRL@ZIF-8 的XRD 圖Fig.8 XRD patterns of CRL@ZIF-8 synthesized by using different 2-methylimidazole concentrations

圖9 不同2-甲基咪唑濃度制備的CRL@ZIF-8 的SEM 圖Fig.9 The SEM images of CRL@ZIF-8 synthesized by using different 2-methylimidazole concentrations

通過對(duì)不同2-甲基咪唑濃度條件下制備的CRL@ZIF-8 的催化活力研究表明，隨著2-甲基咪唑濃度從0.6 mol/L 增加到1.0 mol/L，CRL@ZIF-8 催化PNPB 水解的能力逐漸增強(qiáng)（圖10）。CRL@ZIF-8 的酶活力增強(qiáng)可能是由于隨著2-甲基咪唑濃度的提高，CRL@ZIF-8 的晶體形狀逐漸規(guī)則，分散均勻，從而使得底物傳遞阻力減小，底物更容易接近酶的催化中心，從而提高了催化效率。這些研究結(jié)果證實(shí)了2-甲基咪唑濃度對(duì)CRL@ZIF-8 的形貌結(jié)構(gòu)和催化活性具有重要的調(diào)控作用。

2.1.4 醋酸鋅濃度對(duì)CRL@ZIF-8 的形貌結(jié)構(gòu)和催化活性的影響

一般地講，改變Zn2+供體濃度可以調(diào)控固定化酶的形貌結(jié)構(gòu)和催化活性[18]。本研究考察了利用不同濃度的醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 的差異，結(jié)果如圖11、圖12、圖13 和圖14 所示。

FT-IR 分析表明，隨著醋酸鋅濃度從0.5 mol/L 逐漸增加1.0 mol/L，CRL@ZIF-8 的特異吸收峰無顯著差異（圖11）；XRD 分析表明，不同濃度的醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 的衍射峰分布和強(qiáng)度基本一致（圖12）；SEM 分析表明，不同醋酸鋅濃度條件下，CRL@ZIF-8的形狀和大小沒有明顯的變化（圖13）。這些研究結(jié)果表明，在本研究的試驗(yàn)條件下，醋酸鋅濃度對(duì)CRL@ZIF-8 的形貌結(jié)構(gòu)沒有顯著的調(diào)控作用。

通過對(duì)不同醋酸鋅濃度條件下制備的CRL@ZIF-8 的催化活力研究發(fā)現(xiàn)，隨著醋酸鋅濃度從0.5 mol/L增加到1.0 mol/L，CRL@ZIF-8 的酶活力降低（圖14）。這可能是由于在CRL@ZIF-8 的自組裝過程中，高濃度的醋酸鋅影響了脂肪酶分子CRL 的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了固定化酶催化活性的下降[13]。

圖11 不同醋酸鋅濃度制備的CRL@ZIF-8 的FT-IR 圖Fig.11 FTIR spectra of CRL@ZIF-8 synthesized by using different zinc acetate concentrations

圖12 不同醋酸鋅濃度制備的CRL@ZIF-8 的XRD 圖Fig.12 XRD patterns of CRL@ZIF-8 synthesized by using different zinc acetate concentrations

圖13 不同醋酸鋅濃度制備的CRL@ZIF-8 的SEM 圖Fig.13 The SEM images of CRL@ZIF-8 synthesized by using different zinc acetate concentrations

圖14 不同醋酸鋅濃度制備的CRL@ZIF-8 的酶活Fig.14 The enzymatic activity of CRL@ZIF-8 by using different zinc acetate concentrations

綜合分析上述研究結(jié)果，通過探究不同金屬鹽、反應(yīng)時(shí)間、2-甲基咪唑和醋酸鋅濃度對(duì)CRL@ZIF-8的影響，確定了合成CRL@ZIF-8 的條件：反應(yīng)時(shí)間為30 min，2-甲基咪唑濃度為1.0 mol/L，醋酸鋅濃度為0.5 mol/L。

2.2 CRL@ZIF-8 的溫度耐受性

通過ZIF-8 載體原位自封裝酶分子制備的固定化酶，可以借助ZIF-8 結(jié)構(gòu)的剛性框架，有效地提升酶的穩(wěn)定性[9-10]。本研究考察了CRL@ZIF-8 的溫度耐受性，結(jié)果如圖15 所示。

由圖15 可知，分別將游離脂肪酶和固定化脂肪酶在50 ℃條件下保育30 min 后，游離脂肪酶CRL 的相對(duì)剩余酶活為48%，而CRL@ZIF-8 在30 min 時(shí)的相對(duì)剩余酶活為97%；保育60 min 后，游離脂肪酶CRL 的相對(duì)剩余酶活為43%，而CRL@ZIF-8 的相對(duì)剩余酶活為94%。因此，脂肪酶CRL 經(jīng)過固定化之后，溫度耐受性得到了顯著提升。

圖15 游離酶CRL 和固定化酶CRL@ZIF-8 的溫度耐受性Fig.15 The temperature tolerance of CRL and CRL@ZIF-8

3 結(jié)論

本研究采用ZIF-8 材料原位自封裝皺褶假絲酵母源脂肪酶（CRL）制備固定化脂肪酶（CRL@ZIF-8），研究了金屬離子來源、反應(yīng)時(shí)間、金屬離子和有機(jī)連接體的濃度等因素對(duì)固定化酶催化活性和形貌特征的影響。結(jié)果表明，在反應(yīng)時(shí)間為30 min，2-甲基咪唑濃度為1.0 mol/L，醋酸鋅濃度為0.5 mol/L 時(shí)，合成的CRL@ZIF-8 酶活力最高，達(dá)到9.8 U/g。通過比較游離酶和固定化酶的溫度耐受性，發(fā)現(xiàn)固定化后的脂肪酶CRL@ZIF-8 的溫度穩(wěn)定性有較大提升。