王雪純 曹旭梅 陸瑩 陳麗

摘? 要：為初步研究落地生根凍干粉（BPFP）對(duì)人癌細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度BPFP對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞、人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞和人前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的影響;用Hoechst 凋亡試劑盒檢測(cè)不同質(zhì)量濃度BPFP對(duì)細(xì)胞凋亡的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：BPFP對(duì)HepG2、U87和DU145細(xì)胞生長(zhǎng)均有一定的抑制作用;BPFP作用48 h對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用明顯，抑制率在82%以上，其抑制程度與時(shí)間呈依賴性，但與劑量不呈依賴性;質(zhì)量濃度為150 μg/mL以上作用48 h對(duì)U87細(xì)胞增殖抑制明顯，增殖抑制率大于80%;質(zhì)量濃度為250 μg/mL作用48 h對(duì)DU145增殖抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到100%.BPFP作用24 h對(duì)HepG2、U87和DU145細(xì)胞凋亡均有一定的促進(jìn)作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，BPFP對(duì)HepG2、U87和DU145細(xì)胞的增殖有抑制作用，可能與BPFP能促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān).

關(guān)鍵詞：落地生根凍干粉;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;人肝癌HepG2細(xì)胞;人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞;人前列腺癌DU145細(xì)胞

中圖分類號(hào)：TQ460.7;R285.5? ? ? ? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.01.002

0? ? 引言

腫瘤的治療到目前為止還沒有十分令人滿意的方法，采用手術(shù)、化療和放療等方法盡管有一定療效，但常常對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用.近年來，中醫(yī)藥在癌癥的治療中已經(jīng)起著不可忽視的作用.許多中藥具有抗腫瘤[1-3]的作用，毒性小于化療藥物，對(duì)正常組織細(xì)胞傷害小，與化療藥合用具有減毒增效的作用[4].落地生根（Bryophyllum pinnatum （L.f.） Oken）是景天科（Crassulaceae）落地生根屬（Bryophllurn Salisb）的一種多年生草本植物，在民間又有土三七、葉生根、花蝴蝶、番鬼牡丹或者天燈籠等別名[5].落地生根原產(chǎn)于非洲，現(xiàn)在我國(guó)多地區(qū)均有栽培，集中分布在云南、福建、臺(tái)灣及兩廣地區(qū)，主要用于園藝觀賞.落地生根價(jià)格低廉且易于栽培，全年均可采摘，全草可入藥，性酸，苦，寒，歸經(jīng)肺、腎經(jīng)，具有涼血、解毒消腫、拔毒生肌等功效，民間常用于止刀傷出血、咽喉腫痛、疔瘡、潰瘍或者中耳炎等[6].藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，落地生根具有止血、鎮(zhèn)痛、抗炎[7-8]、抗免疫[9]、抑菌[10-11]、抗氧化[12]等藥理作用，但其抗腫瘤作用鮮有報(bào)道.廣西是中草藥資源大省，落地生根資源豐富，本課題通過研究落地生根凍干粉對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞、人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞和前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的影響，初步篩選對(duì)落地生根敏感的腫瘤細(xì)胞，為進(jìn)一步研究落地生根抗腫瘤作用提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1? ? 材料

1.1? ? 細(xì)胞

人肝癌HepG2細(xì)胞購于中科院細(xì)胞庫;人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株和人前列腺癌DU145細(xì)胞購于武漢博士德生物工程有限公司.

1.2? ?實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清（FBS）、鏈霉素和青霉素（PS）、胰酶均購于上海雙洳生物科技有限公司;CCK-8試劑盒和Hoechst凋亡試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司.

落地生根：采自廣西壯族自治區(qū)柳州市市郊，經(jīng)廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部天然藥物教研室陳君副教授鑒定為景天科（Crassulaceae）落地生根屬（Bryophllurn Salisb）落地生根（Bryophyllum pinnatum （L.f.） Oken）.

落地生根凍干粉[13]及儲(chǔ)備液配制：收集新鮮落地生根500 g，洗凈晾干后用榨汁機(jī)榨汁，汁液冷凍干燥后得凍干粉（BPFP）3.25 g.用培養(yǎng)基溶解制成10 mg/mL（相當(dāng)于生藥量1 538.46 mg/mL）的儲(chǔ)備液，用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度.

1.3? ? 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）;CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（144415-20371，? ? ? 美國(guó)Thermo公司）;熒光倒置顯微鏡（TS2-FL ECLIPSE，日本尼康株氏會(huì)社）;全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)板（Multiskan GO，美國(guó)Thermo公司）;立式高壓滅菌器（LDZF-50L-Ⅱ，上海申安醫(yī)療器械廠）.

2? ? 方法

2.1? ? 細(xì)胞體外培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%的胎牛血清、? ? ? 100 U/mL鏈霉素和青霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中;U87、DU145細(xì)胞分別培養(yǎng)在含10%的胎牛血清+ 100 U/mL鏈霉素和青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中.細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞處于指數(shù)增長(zhǎng)期且融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作.

2.2? ? CCK-8法[14]檢測(cè)BPFP對(duì)HepG2、 U87、 DU145細(xì)胞增殖的影響

分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、U87、DU145細(xì)胞，按每孔5 000～7 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔.待細(xì)胞貼壁后，分別用? ? ? ? ? 50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、 250 μg/mL（分別相當(dāng)于生藥量7.69 μg/mL、15.38 μg/mL、23.08 μg/mL、30.77 μg/mL、38.46 mg/mL）的BPFP處理24 h、48 h和72 h，然后每孔加入10 μL CCK-8試劑培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定OD值，按照式（1）計(jì)算BPFP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

（1）

2.3? ?Hoechst33258染色法[15]檢BPFP對(duì)HepG2、U87、DU145細(xì)胞凋亡的影響

為了研究BPFP影響人癌細(xì)胞的增殖是否與細(xì)胞的凋亡有關(guān)，進(jìn)行了細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn).將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、U87和DU145細(xì)胞，按每孔約5 000個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞貼壁后分別用50 μg/mL、? ? 100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL的BPFP處理24 h，吸出培養(yǎng)基，按照Hoechst凋亡試劑盒說明操作，每孔加入200 μL固定液，固定? ?10 min，吸棄固定液，用PBS洗去固定液，避光加入Hoechst 33258染色5 min，吸棄染色液，用PBS洗去Hoechst 33258，加入1 mL PBS，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況.

2.4? ? 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn);采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)圖片處理.

3? ? 結(jié)果

3.1? ? BPFP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的影響

3.1.1? ? BPFP對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖1是不同質(zhì)量濃度的BPFP分別在24 h、? ?48 h和72 h對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響結(jié)果.從圖1中所顯示的數(shù)據(jù)可看出，各質(zhì)量濃度BPFP對(duì)HepG2作用24 h時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制，但抑制程度不明顯;在作用48 h后，各質(zhì)量濃度BPFP都能明顯抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，但其抑制程度與時(shí)間、劑量不呈依賴性.

3.1.2? ? BPFP對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

圖2是HepG2細(xì)胞給予BPFP 24 h后加入Hoechst 33258染色在熒光倒置顯微鏡下所觀察到的結(jié)果.Hoechst 33258染色后，活細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形的正常藍(lán)色;而凋亡細(xì)胞因染色質(zhì)固縮，其細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染，顏色為亮藍(lán)色.從圖2可見，被固定住的細(xì)胞都已染色，與空白對(duì)照組 （0 μg/mL）比較，不同質(zhì)量濃度BPFP處理后的HepG2細(xì)胞均不同程度出現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，且BPFP質(zhì)量濃度越高，藍(lán)色熒光越多且越明顯，這提示

3.2? ? ?BPFP對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖的影響

3.2.1? ? BPFP對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響

圖3是不同質(zhì)量濃度的BPFP分別處理U87細(xì)胞24 h、48 h和72 h后細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制結(jié)果.由圖3可見，在給藥24 h內(nèi)，BPFP對(duì)U87細(xì)胞增殖抑制 程度與作用劑量和時(shí)間呈依賴性;但在50 μg/mL時(shí)在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用都不明顯;在100 μg/mL作用72 h和150 μg/mL以上濃度作用48 h時(shí)對(duì)U87細(xì)胞增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，抑制率達(dá)80%以上，250 μg/mL作用72 h抑制率更是達(dá)到了100%.

3.2.2? ? BPFP對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響

圖4是U87細(xì)胞給藥24 h后經(jīng)Hoechst 33258染色在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的結(jié)果.隨著BPFP質(zhì)量濃度的增加，觀察到了更多細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、核碎裂和凋亡小體，說明細(xì)胞凋亡與質(zhì)量濃度呈依賴性.

3.3? ? BPFP對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的影響

3.3.1? ?BPFP對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響

圖5是不同質(zhì)量濃度的BPFP處理DU145細(xì)胞24 h、48 h和72 h后細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制結(jié)果.由圖5可見，BPFP對(duì)DU145細(xì)胞增殖抑制作用不具有時(shí)間依賴性，但對(duì)劑量具有一定依賴性.200 μg/mL以下質(zhì)量濃度的BPFP對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用都不明顯，但質(zhì)量濃度達(dá)到250 μg/mL時(shí)對(duì)DU145細(xì)胞有明顯的抑制作用，作用48 h后對(duì)DU145細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到了100%.

3.3.2? ?BPFP對(duì)DU145細(xì)胞凋亡的影響

圖6是DU145細(xì)胞經(jīng)BPFP處理24 h并經(jīng)Hoechst 33258染色后在熒光倒置顯微鏡下觀察的結(jié)果.BPFP在質(zhì)量濃度200 μg/mL以下觀察到的凋亡細(xì)胞非常少，但質(zhì)量濃度在250 μg/mL時(shí)亮藍(lán)色熒光明顯增強(qiáng)增多，說明凋亡細(xì)胞增多.

4? ? 討論與結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BPFP對(duì)HepG2、U87和DU? 145細(xì)胞的增殖具有不同程度的抑制作用：不同質(zhì)量濃度的BPFP處理HepG2細(xì)胞48 h后能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，平均抑制率為87.33%;BPFP質(zhì)量濃度為150 μg/mL及以上作用48 h后對(duì)U87細(xì)胞增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，平均抑制率達(dá)83.19%;BPFP質(zhì)量濃度為250 μg/mL作用DU145細(xì)胞48 h后增殖抑制作用達(dá)到100%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，落地生根具有抗腫瘤作用，可作為抗腫瘤藥物進(jìn)一步開發(fā)和研究.

細(xì)胞凋亡是真核細(xì)胞重要的生物學(xué)現(xiàn)象，在腫瘤治療中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是重要的治療策略[16].細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，最先改變的是體積縮小，連接消失，胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位降低，通透性增加，細(xì)胞色素C釋放到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解為片段，形成凋亡小體[17]，最后被巨噬細(xì)胞吞噬.為了解BPFP抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)，本課題用Hoechst33258染色法觀察了BPFP處理3種細(xì)胞24 h后的染色情況.Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，用于細(xì)胞核染色.BPFP處理3種癌細(xì)胞24 h后用Hoechst33258染色，都能不同程度觀察到濃縮的核質(zhì)及凋亡小體，細(xì)胞凋亡趨勢(shì)與細(xì)胞增殖抑制率趨勢(shì)一致.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，落地生根能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抗腫瘤的作用.

綜上所述，落地生根對(duì)HepG2和DU145細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯，具有潛在的抗肝癌和前列腺癌的作用，可能與BPFP促進(jìn)了細(xì)胞凋亡有關(guān).下一步，課題組將對(duì)落地生根抗腫瘤作用的有效成分進(jìn)行篩選，對(duì)落地生根促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制作進(jìn)一步的研究，同時(shí)尋找落地生根對(duì)敏感腫瘤細(xì)胞的共同作用靶點(diǎn).

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