邢曉華,袁 暉,趙必星

(福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院,福州 350025;*通訊作者,E-mail:heady@126.com)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,簡稱肝癌)發(fā)病率高,死亡率高,是世界范圍內(nèi)第四大惡性腫瘤[1]。目前手術(shù)切除是肝癌治療的首選方式,但預(yù)后仍不理想[2,3],因此,尋找新的抗腫瘤藥物是目前提高肝癌治療療效的首要任務(wù)。

神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育調(diào)控蛋白8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated-8,NEDD8)是最早發(fā)現(xiàn)和研究的類泛素蛋白之一[4],由81個(gè)氨基酸組成,與泛素具有59%的一致性和80%的同源性[5,6]。NEDD8與底物蛋白共價(jià)結(jié)合的過程為NEDD8共價(jià)修飾(neddylation),與泛素化修飾過程類似,也被稱為類泛素化修飾。neddylation也需要經(jīng)過活化酶1(enzyme 1,E1)、結(jié)合酶2(enzyme 2,E2)和連接酶3(enzyme 3,E3)催化將單個(gè)NEDD8分子共價(jià)連接到底物分子上,也是單個(gè)分子在底物上依次累加的過程[7]。

MLN4924是一種單磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)類似物,通過與NEDD8結(jié)合抑制結(jié)合酶E2與NEDD8的結(jié)合,從而抑制了neddylation的發(fā)生過程[8-10]。目前,已有研究證實(shí)MLN4924在實(shí)體惡性腫瘤和血液惡性腫瘤中具有明顯的抑癌作用,其作用機(jī)制主要是誘導(dǎo)DNA重新復(fù)制/損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡/死亡/衰老和自噬、抑制血管生成等[11-13]。由于其在臨床前研究中具有良好的抗腫瘤功效和可耐受的毒性,MLN4924目前正在幾個(gè)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行研究用于腫瘤治療。但目前對(duì)于MLN4924在肝癌中發(fā)揮抗腫瘤效果的作用機(jī)制尚不明確,有待于進(jìn)一步研究。

本研究旨在通過檢測(cè)MLN4924對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲等惡性表型及相關(guān)信號(hào)通路的影響,探討MLN4924抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

Hep3B細(xì)胞購置于美國ATCC。NEDD8抑制劑MLN4924購于美國Selleck公司,CCK-8試劑盒購于Dojundo公司,Transwell小室購于美國Hyclone公司,β-actin,NEDD8,E-cadherin和N-cadherin等抗體購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 Hep3B肝癌細(xì)胞株由含10%胎牛血清(Gibico,美國)的培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí),0.25%胰酶消化,接種至傳代繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí),將細(xì)胞分為3組。MLN4924組使用1 μmol/L的NEDD8的抑制劑MLN4924處理細(xì)胞,陰性對(duì)照組使用等體積的DMSO處理,空白組不作任何處理,4 h后用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗,加入RIPA細(xì)胞裂解液,用細(xì)胞刮刀快速刮下,吸入1.5 ml EP管,置于冰上。

1.2.2 蛋白提取及定量 將EP管置于超聲破碎儀中15 ℃功率30%超聲1 s,停止5 s超聲破碎8 min,全程細(xì)胞置于冰上,4 ℃,17 000g離心10 min,棄沉淀,將上清轉(zhuǎn)入新1.5 ml EP管;加入1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)至其終濃度為8 mmol/L,放入干式恒溫器55 ℃加熱30 min。冷卻后加入500 mmol/L碘乙酰胺(IAA)至其終濃度為50 mmol/L,放入抽屜室溫黑暗反應(yīng)30 min,17 000g離心10 min,取上清備用。BCA法測(cè)定蛋白濃度后用于后續(xù)Western blot檢測(cè)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)NEDD8表達(dá),neddylation水平,以及E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)水平 將上述提取的MLN4924組和陰性對(duì)照組細(xì)胞蛋白樣品用上樣緩沖液稀釋,17 000g離心10 min,取上清進(jìn)行8%SDS-PAGE電泳;100 V恒壓冰浴轉(zhuǎn)印1 h至NC膜,5%BSA封閉4 h后孵育一抗(β-actin,NEDD8,E-cadherin和N-cadherin)4 ℃過夜;次日用TBST緩沖液清洗后孵育相應(yīng)二抗,室溫反應(yīng)1 h,TBST緩沖液清洗后進(jìn)行ECL顯色,并在凝膠成像分析系統(tǒng)中曝光顯影。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖能力 制備2×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,分別加入1 μmol/L的NEDD8抑制劑MLN4924和等體積的DMSO處理作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,取100 μl接種于96孔板,每株細(xì)胞設(shè)置10個(gè)復(fù)孔;需測(cè)定細(xì)胞增殖情況時(shí),加入10 μl CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值;種板后8 h開始測(cè),并記為0 d,隨后分別測(cè)定1,2,3,4 d的吸光度;評(píng)估細(xì)胞增殖能力。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力 細(xì)胞消化后用PBS清洗,離心后用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml進(jìn)行處理。遷移實(shí)驗(yàn)用含基質(zhì)膠的小室,加入200 μl處理的細(xì)胞至Transwell上室,下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM,放入24孔板于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中24 h;用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定液固定,PBS清洗后用結(jié)晶紫染色,雙蒸水清洗數(shù)次后倒扣自然風(fēng)干,然后在顯微鏡下每組隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行拍照和細(xì)胞計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)用含基質(zhì)膠的小室進(jìn)行,其余步驟與侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)參照ibidi Culture-Inserts說明書給定的步驟進(jìn)行。首先制備5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,在Culture-Inserts每一小格加入細(xì)胞懸液70 μl,5%CO2、37 ℃培養(yǎng)過夜;在Culture-Inserts外圍加200 μl培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。用無菌鑷子夾著Culture-Inserts一角,輕輕移除,再用預(yù)熱PBS輕輕潤洗,加入2 ml不含血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中分別含1 μmol/L的NEDD8的抑制劑MLN4924和等體積的DMSO;在0,12,24 h于顯微鏡下拍照,以拔除Culture-Inserts記為0 h。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖,結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLN4924抑制肝癌細(xì)胞neddylation過程

Western blot結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,MLN4924組中NEDD8本體含量增加,而neddylation,即NEDD8經(jīng)共價(jià)修飾后分子量增加的部分減少(見圖1),說明MLN4924能抑制肝癌細(xì)胞neddylation的發(fā)生。

圖1 MLN4924對(duì)NEDD8蛋白表達(dá)及neddylation水平的影響

2.2 MLN4924抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等惡性表型

與陰性對(duì)照組相比,MLN4924組中肝癌細(xì)胞的增殖能力受到抑制,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1,見圖2)。Transwell細(xì)胞遷移驗(yàn)結(jié)果顯示,MLN4924組中Hep3B細(xì)胞在Transwell小室中的遷移數(shù)量為176.00±13.60;而陰性對(duì)照組中遷移細(xì)胞數(shù)量為280.80±10.64,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1,見圖2)。

與陰性對(duì)照比較，****P<0.000 1

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MLN4924組Hep3B細(xì)胞的穿膜數(shù)量為101.80±12.66,而陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)量為206.40±21.33,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1,見圖3)。以上結(jié)果表明,MLN4924能顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。同時(shí),利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)MLN4924對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響,結(jié)果顯示:MLN4924組在劃痕后24 h肝癌細(xì)胞遷移率分別為(56.6±1.6)%,而陰性對(duì)照組的細(xì)胞遷移率為(64.8±2.3)%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖4)。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了MLN4924對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力具有明顯的抑制作用。

與陰性對(duì)照比較，****P<0.000 1

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MLN4924對(duì)細(xì)胞遷移的影響

2.3 MLN4924抑制肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生

與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,均呈紡錘狀成纖維細(xì)胞形態(tài),有偽足;而MLN4924組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生比較明顯改變,細(xì)胞偽足消失,細(xì)胞縮小變圓呈上皮細(xì)胞形態(tài),黏附性變低(見圖5)。結(jié)果提示MLN4924處理可能抑制了肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MLN4924對(duì)肝癌細(xì)胞EMT信號(hào)通路的作用,利用Western blot方法在蛋白水平直接檢測(cè)肝癌細(xì)胞的EMT相關(guān)的表型標(biāo)志物N-cadherin和E-cadherin的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,MLN4924組的的間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin的表達(dá)降低,同時(shí)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)升高(見圖6)。以上結(jié)果證實(shí)了MLN4924可抑制肝癌細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)換。

圖5 MLN4924對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

與陰性對(duì)照比較，*P<0.05，***P<0.001

3 討論

FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)抑制泛素-蛋白酶體過程的藥物是硼替佐米,通過結(jié)合蛋白酶體抑制NF-κB信號(hào)通路從而殺傷細(xì)胞[14],目前已經(jīng)推薦為套細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的一線化療藥物[15,16]。但是目前硼替佐米依然存在比較大的比較普遍的不良反應(yīng),包括腹瀉、心功能損害等[17]。而MLN4924是特異性的NAE抑制劑,可以通過抑制neddylation過程中的NAE酶而抑制NEDD8激活,從而使主要底物Cullin家族蛋白不能被活化,因此可以起到和硼替佐米相同的效果。目前已有關(guān)于MLN4924在各種腫瘤的作用及相關(guān)機(jī)制的研究,MLN4924可以通過抑制UBE2M抑制腎癌細(xì)胞增殖,并且抑制其遷移侵襲[9]。也可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖與遷移[18]。而在肝癌中雖有報(bào)道其可以通過促進(jìn)肝癌保護(hù)性自噬促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[19,20],但其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)制研究目前尚不清楚,有待于進(jìn)一步研究。

在本文中,我們發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞株Hep3B經(jīng)MLN4924處理之后,NEDD8的本體增加,而細(xì)胞內(nèi)特異性類泛素化neddylation廣泛地受到抑制,由此證明MLN4924可以直接抑制NEDD8的功能。而之后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),MLN4924抑制肝癌細(xì)胞的增殖,這與報(bào)道的一致。另外,我們還證實(shí)了MLN4924也可以明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。而后我們觀察到在MLN4924的影響下,肝癌細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生改變,由原有的偽足形成且紡錘狀成纖維細(xì)胞形態(tài)縮小變圓,呈上皮細(xì)胞形態(tài),且偽足消失。證明肝癌細(xì)胞的黏附性降低,由此推測(cè)MLN4924可能抑制了肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程。而后我們檢測(cè)了MLN4924處理后肝癌細(xì)胞中EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)E-cadherin分子表達(dá)明顯上升,而N-cadherin分子表達(dá)明顯下降,說明NEDD8確實(shí)可以通過提高細(xì)胞E-cadherin表達(dá)來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT。

本研究證實(shí)MLN4924可以顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性表型。并且MLN4924處理后的肝癌細(xì)胞的黏附性降低。并且進(jìn)一步證明了MLN4924可抑制EMT信號(hào)通路。但是腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的過程,機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,具體的內(nèi)在機(jī)制需要我們進(jìn)一步的深入研究。