（常州制藥廠有限公司，江蘇 常州 213000）

關(guān)健詞：超高效液相色譜法；阿托伐他汀鈣；有關(guān)物質(zhì)

阿托伐他汀鈣是HMG-CoA還原酶的選擇性、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能通過(guò)抑制肝臟內(nèi)HMG-CoA還原酶和膽固醇的合成，降低血漿中膽固醇和脂蛋白水平；并通過(guò)增加肝細(xì)胞表面的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）受體以增強(qiáng)LDL-C攝取和代謝。阿托伐他汀鈣可降低純合子型和雜合子型家族性高膽固醇血癥、非家族性高膽固醇血癥和混合型血脂異?；颊叩目偰懝檀迹═C），LDL-C和載脂蛋白B水平，為新一代他汀類降血脂藥。

現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、各國(guó)藥典[1-3]及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4-12]中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，存在分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、分離度較差等問(wèn)題，均不能很好分離本文中涉及的15個(gè)雜質(zhì)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，參考各國(guó)藥典，采用靈敏度和分離度更高、分析速度更快的超高效液相色譜法（UPLC）測(cè)定阿托伐他汀鈣中的雜質(zhì)。本論文所建立的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，分離度與重復(fù)性好，分析效率高。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津Nexera X2 LC-30AD超高壓液相色譜儀，島津Nexera X2 SPD-M30A光電二極管陣列檢測(cè)器（日本島津公司）；Waters Empower 3軟件（美國(guó)沃特世公司）；XP6百萬(wàn)分之一電子天平，XP205DR十萬(wàn)分之一電子天平，F(xiàn)E20 pH計(jì)（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥

阿托伐他汀鈣原料藥（常州制藥廠有限公司，批號(hào)：EAT190401，EAT190402，EAT190403，EAT190404，EAT191101，EAT191102，EAT191103，EAT191104）；阿托伐他汀鈣，雜質(zhì)A、B、C、D對(duì)照品（USP）；雜質(zhì)M、O、P對(duì)照品（QCCUSA公司）；雜質(zhì)L、N對(duì)照品（Trc公司）；雜質(zhì)F、G、H、I、J、K（常州制藥廠有限公司合成制備，經(jīng)紫外、紅外、質(zhì)譜和核磁共振分析結(jié)構(gòu)確證）；乙腈，甲醇，N,N-二甲基甲酰胺（DMF），四氫呋喃（無(wú)穩(wěn)定劑）為色譜純；冰醋酸，醋酸銨為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津Shim-pack Velox PFPP（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A：3.9 g/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0）:乙腈:甲醇:四氫呋喃（無(wú)穩(wěn)定劑）=67:21:6:6，流動(dòng)相B：3.9 g/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調(diào)pH至5.0）:乙腈:甲醇:四氫呋喃（無(wú)穩(wěn)定劑）=27:61:6:6，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速：0.43 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：244 nm；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：10 ℃；進(jìn)樣量：1.8 μl；稀釋液：DMF。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度

2.2 溶液的制備

雜質(zhì)定位溶液：依次稱取阿托伐他汀鈣對(duì)照品、雜質(zhì)A（阿托伐他汀脫氟物）、雜質(zhì)B （阿托伐他汀非對(duì)映異構(gòu)體）、雜質(zhì)C （阿托伐他汀雙氟物）、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F（阿托伐他汀二聚物）、雜質(zhì)G（阿托伐他汀甲酯）、雜質(zhì)H（阿托伐他汀內(nèi)酯）、 雜質(zhì)I、雜質(zhì)J（阿托伐他汀乙酯）、雜質(zhì)K（阿托伐他汀叔丁酯）、雜質(zhì)L、雜質(zhì)M、雜質(zhì)N、雜質(zhì)O、雜質(zhì)P對(duì)照品各5 mg，分別置入16個(gè)100 ml量瓶，加稀釋液溶解稀釋至刻度，搖勻。

系統(tǒng)適應(yīng)性溶液：稱取阿托伐他汀鈣對(duì)照品和雜質(zhì)A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P對(duì)照品各2.5 mg，置入同一50 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：精密稱取阿托伐他汀鈣對(duì)照品和各雜質(zhì)A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P對(duì)照品各5 mg，分別置入同一100 ml量瓶，加稀釋液溶解稀釋至刻度，搖勻，再精密移取5 ml至25 ml量瓶，加稀釋液至刻度，搖勻作為線性貯備液，再分別移取0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml線性貯備液，置入10 ml量瓶，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻（相對(duì)于樣品中雜質(zhì)含量分別為0.03 %，0.05 %，0.10 %，0.15 %，0.20 %，0.25 %，0.30 %），作為線性溶液。

供試品溶液：稱取阿托伐他汀鈣樣品約50 mg，置入50 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

對(duì)照溶液：量取1 ml供試品溶液，置入100 ml量瓶，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻。再量取5 ml，置入50 ml量瓶，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻。

降解實(shí)驗(yàn)溶液：稱取阿托伐他汀鈣樣品7份，每份50 mg，分別置入50 ml量瓶，分別進(jìn)行酸破壞（加0.5 mol/L鹽酸溶液2 ml，放置24 h，加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml調(diào)pH至中性）、堿破壞（加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液4 ml，放置 24 h，加0.5 mol/L鹽酸溶液4 ml調(diào)pH至中性）、氧化破壞（加30 %雙氧水4 ml放置14 d）、光照破壞（置于4500±500 Lx下光照40 d）、高溫破壞（置于105 ℃放置40 d）、高濕破壞（置相對(duì)濕度92.5 %放置40 d）和未進(jìn)行破壞。取上述樣品，分別加稀釋液溶解稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液；移取各破壞的供試品溶液1 ml，置入100 ml量瓶，加稀釋液定容，搖勻；再移取5 ml，置入50 ml量瓶，加稀釋液至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液；精密稱取阿托伐他汀鈣對(duì)照品25 mg，置入25 ml量瓶，加稀釋液溶解，定容，搖勻，再精密吸取10 ml，置入25 ml量瓶，加稀釋液溶解，定容，搖勻，作為含量對(duì)照品溶液（用于質(zhì)量平衡）；精密吸取各破壞的供試品溶液10 ml，置入25 ml量瓶，加稀釋液稀釋至刻度，作為含量供試品溶液。

2.3 結(jié)果

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液和各雜質(zhì)定位溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果表明，本色譜條件下，阿托伐他汀鈣主峰及各雜質(zhì)峰間均能達(dá)到良好的分離，分離度均在1.5以上（見(jiàn)圖1）。

AT：阿托伐他汀鈣；IMP：雜質(zhì)圖1 系統(tǒng)適應(yīng)性圖譜注：雜質(zhì)D和雜質(zhì)M均出二個(gè)色譜峰

2.3.2 線性關(guān)系考察 取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，由質(zhì)量濃度（μg/ml）對(duì)峰面積做線性回歸方程并計(jì)算其校正因子，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。結(jié)果表明，阿托伐他汀鈣和各雜質(zhì)均在0.3～3.0 μg/ml范圍內(nèi)線性良好。

表2 線性數(shù)據(jù)

2.3.3 檢測(cè)限和定量限 精密移取各雜質(zhì)定位溶液適量，用稀釋液逐級(jí)稀釋，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，按信噪比S/N=10計(jì)算定量限，定量限溶液連續(xù)6針?lè)迕娣eRSD均小于10 %，各雜質(zhì)定量限濃度水平均小于0.03 %（相對(duì)于樣品中雜質(zhì)含量）；按信噪比S/N=3計(jì)算檢測(cè)限,各雜質(zhì)檢測(cè)限濃度水平均小于0.01 % （相對(duì)于樣品中雜質(zhì)含量），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 檢測(cè)限和定量限

2.3.4 回收率試驗(yàn) 精密稱取雜質(zhì)A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P對(duì)照品各5 mg，分別置入同一100 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密移取10 ml，置入50 ml量瓶，加稀釋液至刻度，搖勻，作為回收率貯備液，精密稱取阿托伐他汀鈣樣品20 mg共12份，分別置入20 ml量瓶，再分別移取0.6，2.0，3.0，6.0 ml回收率貯備液置入20 ml量瓶，共3份，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻（相對(duì)于樣品中雜質(zhì)含量分別為0.03 %，0.10 %，0.15 %，0.30 %），作為回收率供試品溶液。照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定上述12份溶液，計(jì)算每個(gè)雜質(zhì)回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表4，各雜質(zhì)回收率均約100 %，且平行性較好。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=12）

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取阿托伐他汀鈣樣品20 mg，共6份，分別置入20 ml量瓶，再分別移取2.3.4項(xiàng)下回收率貯備液3.0 ml，置入20 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻（相對(duì)于樣品中雜質(zhì)含量為0.15 %）作為重復(fù)性試驗(yàn)供試品溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測(cè)定6份重復(fù)性試驗(yàn)供試品溶液，6份供試品溶液中各雜質(zhì)含量RSD均小于5.0 %，結(jié)果表明，本方法本儀器重復(fù)性良好。

2.3.6 精密度試驗(yàn)

2.3.6.1 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 照2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測(cè)定對(duì)照溶液6次，按峰面積計(jì)算RSD為0.1 %，結(jié)果表明，本方法本儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.3.6.2 中間精密度試驗(yàn) 不同天，由另一名檢驗(yàn)員，使用另一臺(tái)UPLC儀器，按2.3.5項(xiàng)下方法配制6份中間精密度試驗(yàn)溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)測(cè)定6份溶液，計(jì)算6個(gè)溶液中各雜質(zhì)含量RSD均小于5.0 %。同時(shí)計(jì)算兩名檢驗(yàn)員間12份溶液各雜質(zhì)含量RSD均小于5.0 %。結(jié)果表明，本方法中間精密度良好。

2.3.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取阿托伐他汀鈣樣品約50 mg，置入50 ml量瓶，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液，于儀器樣品室中（10 ℃），分別于0，4，8，12，18，24，32，40，48 h，照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液48 h內(nèi)較穩(wěn)定（與初始值0 h比較，無(wú)新增雜質(zhì)，無(wú)雜質(zhì)消失，各雜質(zhì)增減在0.05 %之內(nèi)）。

2.3.8 耐用性考察 根據(jù)2.1項(xiàng)下色譜條件，采用不同品牌PFPP UPLC色譜柱、柱溫（33，37 ℃）、流速（0.41，0.45 ml/min）、波長(zhǎng)（242，246 nm）、流動(dòng)相A中各組份比（66:22:6:6，68:20:6:6，67:21:5.8:6.2，67:21:6.2:5.8）和流動(dòng)相B中各組份比（26:62:6:6，28:60:6:6，27:61:5.8:6.2，27:61:6.2:5.8），依次按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性溶液試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同品牌PFPP UPLC色譜柱保留時(shí)間差異較大，如不使用推薦色譜柱，可能造成雜質(zhì)A、L、B及主峰分離不夠；其他參數(shù)的微小變化下，各雜質(zhì)峰間均能達(dá)到較好分離，基本不影響檢測(cè)。上述結(jié)果表明除對(duì)色譜柱要求較高外，本方法耐用性較好。

2.3.9 降解試驗(yàn)結(jié)果 照2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣降解試驗(yàn)溶液分析，結(jié)果見(jiàn)表5。在酸破壞、堿破壞、氧化破壞、高溫破壞、光照破壞、高濕破壞等條件下，可檢出除雜質(zhì)A、雜質(zhì)M、雜質(zhì)G、雜質(zhì)I除外的11個(gè)已知雜質(zhì)，且阿托伐他汀鈣主峰及檢出各雜質(zhì)峰的峰純度均符合要求（峰純度閾值大于峰純度角值），且質(zhì)量保持平衡。表明此法專屬性好，能有效檢測(cè)樣品中的降解產(chǎn)物。

表5 降解試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.3.10 樣品檢測(cè)結(jié)果 對(duì)8個(gè)批次阿托伐他汀鈣樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表6，第1～4批次樣品均未檢出文中研究的15個(gè)雜質(zhì)，均檢出未知雜質(zhì)，雜質(zhì)總量均在0.1 %左右，第5～8批次樣品均檢出雜質(zhì)L，且第6～7批次樣品均檢出已知雜質(zhì)F，但上述雜質(zhì)含量均較低，單個(gè)雜質(zhì)含量均低于0.1 %，雜質(zhì)總量均低于0.15 %。

表6 8個(gè)批次樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 UPLC檢測(cè)方法建立的必要性

檢測(cè)上述15個(gè)已知雜質(zhì)是各國(guó)藥典以及相關(guān)企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)在要求。在酸破壞、堿破壞、氧化破壞、高溫破壞、光照破壞、高濕破壞等條件下，可檢出除雜質(zhì)A、雜質(zhì)M、雜質(zhì)G、雜質(zhì)K、雜質(zhì)I的10個(gè)已知雜質(zhì)，上述破壞試驗(yàn)提示：在倉(cāng)儲(chǔ)、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中均有可能降解產(chǎn)生上述雜質(zhì)，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此建立簡(jiǎn)單、便捷、可定量的方法對(duì)控制產(chǎn)品質(zhì)量有重要的實(shí)際價(jià)值。相較于傳統(tǒng)HPLC方法，UPLC方法有分析時(shí)間更短、檢測(cè)靈敏度更高，進(jìn)樣量更小等優(yōu)勢(shì)，更適應(yīng)生產(chǎn)企業(yè)高效率檢測(cè)等需要。

3.2 流動(dòng)相選擇

流動(dòng)相選擇參考了美國(guó)和歐洲藥典收載流動(dòng)相體系，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化選擇后最終確定。驗(yàn)證過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，甲醇和四氫呋喃的用量對(duì)有些雜質(zhì)之間分離影響較大，且四氫呋喃對(duì)基線梯度影響較大，因此需準(zhǔn)確量取甲醇和四氫呋喃。四氫呋喃應(yīng)不添加穩(wěn)定劑，如含穩(wěn)定劑會(huì)影響主峰前后的基線，影響雜質(zhì)A，L，B檢出能力及對(duì)照溶液主峰峰面積。同時(shí)要特別注意密封保存，防止水分及氧化物質(zhì)進(jìn)入使四氫呋喃變質(zhì)，影響檢驗(yàn)。

3.3 小結(jié)

本文以UPLC測(cè)定阿托伐他汀鈣原料藥中有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果表明，本法保留時(shí)間穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高、回收率符合檢測(cè)要求。與常規(guī)液相色譜法比較，分析時(shí)間大幅縮短，分離效率高，重復(fù)性好，溶劑用量少，環(huán)保經(jīng)濟(jì)，可用于阿托伐他汀鈣原料藥的有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制。