王存堂 高增明 張福娟 姜辰昊 孟慶怡

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，齊齊哈爾 161006)(朝陽師范高等專科學(xué)校生化工程系2，朝陽 122000)

大米是世界主要的糧食作物之一，也是我國和東南亞國家的主食之一，大米及其產(chǎn)品具有很大的商業(yè)潛力[1]。大米淀粉顆粒較小、質(zhì)地細膩、大米淀粉糊化后吸水快、容易分散涂抹，且過敏性較低，因此，大米及其淀粉在方便食品、化妝品、嬰兒食品及功能性食品基料等方面用途廣泛[2]。由于大米及其制品在儲存過程中淀粉回生率很高，易出現(xiàn)硬度增加、水分減少等回生現(xiàn)象，導(dǎo)致其口感劣變、保質(zhì)期縮短，成為制約大米及其米制品工業(yè)發(fā)展的一個重要問題。因此，如何調(diào)控大米及其淀粉制品的回生特性，成為大米及其淀粉制品加工及貯藏過程中的關(guān)鍵所在。

大米淀粉的回生過程是糊化后的淀粉分子從雜亂無序的分子狀態(tài)通過重結(jié)晶過程逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛行蚪Y(jié)晶狀態(tài)的過程[3]，因此可以通過調(diào)控淀粉分子之間相互作用過程，實現(xiàn)延緩大米淀粉回生的目的。目前，植物多酚類物質(zhì)常被作為一種天然的抗氧化劑添加到淀粉質(zhì)食品中，研究發(fā)現(xiàn)植物多酚類物質(zhì)能抑制淀粉的回生進程，其影響淀粉回生的原因較多，如淀粉來源、多酚結(jié)構(gòu)以及多酚的添加量等，如綠茶多酚提取物可顯著抑制大米和馬鈴薯淀粉的回生[4]，而黑茶多酚能顯著抑制蠟質(zhì)大米淀粉和大米淀粉的回生，但對馬鈴薯淀粉的糊化和回生特性無明顯影響[5]，原花青素可抑制大米淀粉的回生[6]，葡萄籽提取物可抑制蠟質(zhì)玉米淀粉的回生[7]，然而，蘆丁和槲皮素對小麥淀粉的回生進程卻具有促進作用[8]。黑豆皮中富含花色苷類成分，具有降血壓、降血脂、降血糖、抑制肥胖和抗氧化及清除自由基等多種生理活性[9]，其乙醇提取物中花色苷含量為26.9%，其主要成分是矢車菊素-3-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芍藥色素-3-O-葡萄糖苷等[10]。但是黑豆皮花色苷類物質(zhì)對大米淀粉理化性質(zhì)和回生性質(zhì)的影響鮮見報道。因此，本研究將黑豆皮乙醇提取物(Ethanol Extract of Black Soybean Coats, EBSC)添加到大米淀粉中，通過分析大米淀粉的透明度、老化度、溶解度、膨脹度以及凝膠強度的變化，探討EBSC對大米淀粉理化性質(zhì)的影響；采用差式掃描量儀(DSC)測定其糊化和回生的熱力學(xué)性質(zhì)，評價EBSC對大米淀粉回生的影響，同時分析了EBSC對大米淀粉體外消化性能的影響，從而為黑豆皮花色苷類物質(zhì)在大米及其淀粉制品中的廣泛應(yīng)用，開發(fā)出更多新穎、營養(yǎng)健康的大米及其淀粉類產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆皮取自齊齊哈爾市瀏園市場；大米淀粉(含水量14.62%)；糖化酶(100 000 U/g)、豬胰α淀粉酶(20 000 U/mL，)、氫氧化鈉、乙酸、乙醇、無水乙酸鈉、重苯酚、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉均為分析純。

2L-ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，GX-220高速不銹鋼多功能粉碎機，UPG-722可見分光光度計，C-LM型數(shù)顯式剪切力儀，2.5LfreezePrysystem真空冷凍干燥機，STA449F3同步熱分析儀。

1.2 方法

1.2.1 EBSC制備

取粉碎的黑豆皮100 g，然后加入70%乙醇200 mL，在25 ℃下浸提2 h，然后將浸提液經(jīng)6 000 r/min的離心處理，取上清液備用。離心后的沉渣再次經(jīng)過浸提、離心處理，合并2次離心上清液。將合并后的提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中真空濃縮(50 ℃)，再將濃縮液冷凍干燥即為EBSC(得率為10.28%，總酚含量42.12%)，將EBSC儲存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 大米淀粉透明度測定

取大米淀粉 1.0 g，加入占大米淀粉質(zhì)量分別為0%、1%、2.5%、5.0%、10.0%的EBSC進行混合，然后加入100 mL去離子水配制成大米淀粉-EBSC混合溶液， 90 ℃水浴加熱30 min，隨即冷卻到20 ℃，振蕩器搖勻，在620 nm處測定吸光度值，并將樣品在4 ℃下分別冷藏1、3、5、7 d后，將樣品搖勻后在620 nm處測定淀粉溶液的吸光度值，并用去離子水做空白[11]。

1.2.3 大米淀粉溶解度、膨脹度測定

取大米淀粉 1.0 g，加入占大米淀粉質(zhì)量分別為0%、1%、2.5%、5.0%、10.0%的EBSC進行混合，然后加入100 mL去離子水配制成大米淀粉-EBSC混合溶液，在90 ℃下加熱30 min，然后冷卻到室溫，在4 000 r/min離心10 min，將上清液倒入培養(yǎng)皿中在水浴鍋上蒸干，并在105 ℃烘箱中烘干至恒重。稱取被溶解淀粉的質(zhì)量記為A，按式(1)計算淀粉的溶解度S，離心管剩余淀粉糊的質(zhì)量計為P，按式(2)計算淀粉的膨脹度B[11]。

淀粉溶解度S=A/W×100%

(1)

淀粉膨脹度B=P/[W(1-S)]100%

(2)

1.2.4 大米淀粉老化度測定

取大米淀粉 1.0 g，加入占大米淀粉質(zhì)量分別為0%、1%、2.5%、5.0%、10.0%的EBSC進行混合，然后加入100 mL去離子水配制成大米淀粉-EBSC混合溶液，在90 ℃下加熱30 min，然后冷卻到室溫，將其分裝到離心管中，并在4 ℃下靜置冷藏1、3、5、7 d后，記錄上清液的體積[11]。

淀粉老化度=(上清液體積/淀粉糊總體積)×100%

(3)

1.2.5 大米淀粉凝膠硬度測定

按照廖盧艷等[12]的方法并做修改。準確稱量20 g 大米淀粉，分別加入占大米淀粉質(zhì)量的0、1%、2.5%、5.0%、10.0%的EBSC進行混合，再加入25 mL去離子水配制成淀粉溶液，在90 ℃下加熱30 min使其糊化，冷卻至室溫后，裝進 10 mL 的注射器中冷卻，并在4 ℃下冷藏1、3、5、7 d后，形成直徑為 1.5 cm 的圓柱形凝膠。測試前將凝膠倒出切成直徑為 1.5 cm 高 2 cm 的小圓柱形體在CL-M型剪切力儀上進行凝膠硬度測定，凝膠柱被切斷時所受的力的大小(N)即為凝膠硬度。此值越大，說明凝膠硬度越大。

1.2.6 大米淀粉回生樣品的制備

取大米淀粉 10 g，分別加入占淀粉干質(zhì)量0%、1.0%、2.5%、5%、10%的EBSC混合，并加入20 mL水后在121 ℃下糊化20 min。將糊化后樣品放入4 ℃冰箱內(nèi)貯存15 d后，將樣品凍干后研磨，過120目篩后，備用。

1.2.7 糊化和回生大米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)測定

采用差式掃描量熱儀法(DSC)對糊化和回生大米淀粉的熱力學(xué)性質(zhì)進行測定[6]。分別添加0%、1%、2.5%、5%及10%(占大米淀粉干質(zhì)量)的EBSC于大米淀粉中。稱取2 mg EBSC-大米淀粉混合樣品加入PE坩堝中，按1∶2(m∶m)比例加入去離子水。將混合樣品密封后，在4 ℃條件下靜置24 h后在DSC上進行糊化焓值測定。測定條件如下：以10 ℃/min的速度從30 ℃升溫到120 ℃，以空坩堝作對照，氮氣為載氣，氣流流速為20 mL/min。根據(jù)糊化溫度曲線，可以確定出淀粉糊化過程中的起始溫度(To)、峰值溫度(Tp)、終止溫度(Tc)和糊化焓值(ΔHg)。然后測定1.2.6中EBSC-大米淀粉混合物回生樣品的起始溫度(To)、峰值溫度(Tp)、終止溫度(Tc)和回生焓值(ΔHr)，升溫程序與測定條件和測定糊化焓值的相同，根據(jù)回生溫度曲線可以確定并計算樣品的回生率DR，即相同EBSC添加量的大米淀粉的回生焓和糊化焓的比值，DR=(ΔHr/ΔHg)×100%。

1.2.8 回生大米淀粉的體外消化性能測定

根據(jù)Englyst法進行大米淀粉體外消化實驗，分別配制含0%、1%、2.5%、5%、10%EBSC的大米淀粉混合樣品。取100 mg 樣品，加入25 mL乙酸鈉緩沖液(pH5.2)，振蕩混勻后加入 5 mL 混合酶溶液(20 000 U/mL豬胰腺 α-淀粉酶與10 000 U/mLα-葡萄糖苷酶)。在氣浴(37 ℃)條件下振蕩反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng) 20、120 min 時分別取出反應(yīng)液 1 mL，隨機滅酶處理(加入 5 mL 95%的乙醇)，然后離心處理(5 000 r/min，10 min)。取1 mL 離心上清液，加入 DNS 溶液 2 mL后沸水浴 5 min，隨即定容至 15 mL，在 520 nm處測其吸光度值。以葡萄糖為標準品，做標準曲線，方程式為y=1.613 4x-0.083 2，R2=0.999 1，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算淀粉在20、120min生成還原糖的含量[13]。

快消化淀粉(RDS)=[(G20-FG)/TS]0.9×100%

(4)

慢消化淀粉(SDS)=[(G120-G20)/TS]0.9×100%

(5)

抗性淀粉(RS)=[(TS-G120)/TS]×0.9×100%

(6)

式中：G20為酶水解20 min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；FG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖質(zhì)量/mg；G120為酶水解120 min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；TS為樣品中總淀粉質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均3次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標準偏差。采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，并進行Duncan’s差異顯著性分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBSC對大米淀粉透明度的影響

淀粉的透明度代表了淀粉分子與水分子的結(jié)合能力，由于淀粉與水共熱的條件下，淀粉分子吸水膨脹，支鏈和直鏈分子不斷進行氫鍵之間的交聯(lián)作用，交聯(lián)程度越大透明度越低，反之締合程度越小，透明度越高[14]。同時隨著儲藏時間的延長，淀粉回生程度的增加也會導(dǎo)致淀粉透明度下降。

由圖1可知，隨著儲藏時間的延長，添加不同量的EBSC淀粉的透明度逐漸下降。當(dāng)EBSC的添加量為2.5%，大米淀粉透明度的增加幅度最大，但添加10%EBSC對淀粉透明度的抑制效果不如添加量為2.5%EBSC的淀粉，可能的原因是提取物中多酚類物質(zhì)的多羥基結(jié)構(gòu)可以阻礙淀粉分子之間的交聯(lián)，從而使得淀粉分子不能形成有序的排列，導(dǎo)致透明度的上升。而過量的提取物除了與淀粉分子結(jié)合干擾其內(nèi)部重組，剩余的提取物則游離在淀粉糊的周圍阻礙了光線的傳遞，導(dǎo)致其透明度有所下降。淀粉來源、多酚結(jié)構(gòu)的差異以及多酚的添加量對淀粉透明度的影響差異很大?；ㄇ嗨睾蛢翰杷丶尤胂炠|(zhì)玉米淀粉，可導(dǎo)致淀粉糊透明度顯著增加[11]，苦蕎多酚的添加可導(dǎo)致蕎麥淀粉和小麥淀粉的透光率顯著下降[8]，而在蠟質(zhì)玉米淀粉中添加咖啡酸、綠原酸、沒食子酸以及單寧酸，則淀粉糊的透明度變化不顯著[11]。

注：不同小寫字母為同一處理組的不同回生時間之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母為不同處理組之間差異顯著(P<0.05)。圖1 EBSC的添加量對大米淀粉透明度的影響

2.2 EBSC對大米淀粉溶解度和膨脹度的影響

淀粉的溶解度和膨脹度是淀粉與水在加熱的條件下最基本的物理性質(zhì)之一，可以通過溶解度和膨脹度的大小來直觀判斷淀粉與水之間相互作用力的強弱。淀粉在常溫下不溶于水，但是淀粉在受熱時，直鏈淀粉析出和水分子不斷形成氫鍵，淀粉開始少量溶解，隨著加熱時間的延長，未溶解的淀粉開始吸水膨脹，分子內(nèi)部的作用力不斷減小，膨脹度增大[11]。由圖2可知，EBSC可顯著提高大米淀粉的溶解度和膨脹度，與對照組相比，添加10%EBSC的大米淀粉溶解度和膨脹度分別提高了約2.7倍和2倍。這可能是因為EBSC中羥基基團能夠進入到淀粉分子的內(nèi)部，從而產(chǎn)生一定的空間位阻，導(dǎo)致直鏈、支鏈淀粉的大量析出，溶解度增大，同時阻礙了淀粉分子之間的聚合力，使其內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得蓬松，從而膨脹度增大[15]。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸、原花青素、咖啡酸、兒茶素、綠原酸和阿魏酸均能減小玉米淀粉的溶解度和膨脹度[11]。由此可見，由于淀粉來源和多酚結(jié)構(gòu)以及多酚的添加量的不同，對淀粉溶解度和膨脹度的影響差異很大。

注：不同小寫字母為不同處理組之間差異顯著(P<0.05)。圖2 EBSC的添加量對大米淀粉溶解度和膨脹度的影響

2.3 EBSC對大米淀粉老化度的影響

淀粉的老化度可以用淀粉的持水能力大小來表示。糊化后的淀粉分子在冷卻的過程中，處于無序狀態(tài)的分子與分子之間開始互相碰撞、結(jié)合，而在分子結(jié)合成有序狀態(tài)的過程中促使水分析出，從而導(dǎo)致淀粉的持水能力下降。當(dāng)?shù)矸畚龀龅乃衷蕉鄷r，則表明淀粉的持水能力越小，也即淀粉的老化程度越大[13]。

由圖3可以看出，隨著儲存時間的延長，大米淀粉的老化度逐漸升高，代表淀粉的回生程度加大。與對照組相比，在淀粉中添加不同添加量的EBSC對淀粉的老化度有一定的抑制作用，添加量為2.5%時，抑制效果最為顯著。此外，隨著儲存時間的延長，添加不同添加量的EBSC淀粉的老化速率也有一定的減緩?？赡艿脑蚴嵌喾宇惢衔锞哂卸嗔u基結(jié)構(gòu)，可與淀粉分子形成氫鍵，從而阻礙了淀粉分子之間氫鍵的形成，抑制多酚淀粉老化的進程[5]。研究發(fā)現(xiàn)，綠茶提取物可以降低大米、玉米和馬鈴薯淀粉的老化進程，而且綠茶提取物對大米淀粉和玉米淀粉的老化抑制效果優(yōu)于馬鈴薯淀粉[4]，柑橘黃酮(柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷)可以延緩玉米淀粉的老化進程[16]，而蘆丁或槲皮素則加快了小麥淀粉老化進程[17]。由此可見，植物多酚類物質(zhì)對淀粉的老化的影響因素較為復(fù)雜，淀粉來源、植物多酚結(jié)構(gòu)以及多酚的添加量等均對淀粉老化度的影響較大。

2.4 EBSC對回生大米淀粉凝膠強度的影響

淀粉回生過程中硬度變化是淀粉類食物最主要的感官特性之一，因此也是淀粉類食品最重要的評價指標之一[11]。淀粉類食物在貯存過程中，老化程度加劇導(dǎo)致淀粉類食品的硬度增加，口感變差。淀粉糊化后在冷卻的過程中，分子內(nèi)部相互交纏形成一個三維的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠狀態(tài)，其具有一定的硬度[18]。

從圖4可知，在貯存過程中，大米淀粉凝膠強度呈總體升高的趨勢，且當(dāng)回生時間相同時，隨著EBSC添加量的增加而顯著降低(P<0.05)。由于淀粉回生過程中，淀粉分子內(nèi)部的支鏈分子外側(cè)無數(shù)的分支結(jié)構(gòu)逐漸纏繞形成結(jié)晶區(qū)，從而導(dǎo)致淀粉分子凝膠強度的增大[18]。而加入EBSC后，對淀粉回生過程中凝膠強度的增大有一定的抑制作用，說明添加EBSC對大米淀粉分子內(nèi)部微晶束的形成有一定的干擾作用，破壞了淀粉分子內(nèi)部凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。相似地，有研究表明蘆丁或槲皮素的添加可降低小麥淀粉的凝膠硬度[17]，同時茶多酚也可以導(dǎo)致甘薯淀粉的凝膠硬度顯著下降[19]。

圖4 EBSC的添加量對大米淀粉凝膠強度的影響

2.5 EBSC對大米淀粉糊化熱力學(xué)性質(zhì)的影響

淀粉糊化的熔融焓值代表在與水共熱的條件下，解開淀粉分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)能量的大小，其本質(zhì)是親水性的羥基基團與支鏈淀粉的側(cè)鏈相互作用，并在不同程度上結(jié)合到淀粉顆粒的無定形區(qū)域，從而改變結(jié)晶區(qū)和無定形基質(zhì)之間的耦合力[11]。由表1可以看出添加不同添加量的EBSC淀粉的糊化起始溫度(T0)和糊化焓值(ΔH)與對照組相比均有下降的趨勢。植物多酚類物質(zhì)，如原花青素、苦蕎多酚等含有較多羥基，容易與淀粉的側(cè)鏈發(fā)生相互作用，能在一定程度上促進淀粉的糊化[6, 8]。這被認為是由于多酚的羥基，并與淀粉的非結(jié)晶區(qū)域發(fā)生不同程度的結(jié)合，從而改變晶體與非晶體之間的耦合矩陣，使得淀粉在糊化時所需的能量減小[1]。

表1 黑豆皮乙醇提取物添加量對大米淀粉糊化熱力學(xué)特性影響

2.6 EBSC對回生大米淀粉熱力學(xué)性質(zhì)的影響

在低溫條件下貯存時，糊化后淀粉分子之間可以形成以氫鍵結(jié)合的晶體聚合物[21]。淀粉回生焓值(ΔHr)則是指當(dāng)?shù)矸劬w聚合物發(fā)生熔融時所需要的能量，所以當(dāng)ΔHr 的值越大，說明淀粉的回生程度越大[20]。

由表2可以看出，隨著EBSC添加量的增大，回生焓值和DR值均逐漸下降，說明淀粉晶體堆積的能力逐漸減弱，淀粉回生程度逐漸降低。Xiao等[4]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可降低大米淀粉老化焓值，植物多酚中的羥基易與淀粉中的羥基形成氫鍵，這個過程可以抑制淀粉多聚物鏈的形成，從而使得回生淀粉的重結(jié)晶在熔融時所需的能量下降。

2.7 EBSC對大米淀粉體外消化的影響

淀粉的來源、淀粉顆粒的大小、淀粉中支鏈與直鏈淀粉含量之間的比值、淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)以及分解淀粉的酶的活性等[21]都會對淀粉的消化性能產(chǎn)生影響。

由表3可知，隨著EBSC添加量的增加，大米淀粉的RDS含量逐漸下降，SDS、RS含量逐漸上升；而隨著回生天數(shù)的增加，所有大米淀粉樣品的RDS含量也呈現(xiàn)下降趨勢，說明隨著回生時間的延長，淀粉的消化性逐漸變差。當(dāng)EBSC添加量為10%時，與對照組相比，在4 ℃回生5 d 的大米淀粉中的RDS下降了57.01%，SDS和RS分別增加了約2倍和19倍。由此可知，在淀粉中添加一定比例的EBSC可以顯著抑制淀粉的消化性能，可能的原因是淀粉分子外部結(jié)構(gòu)被EBSC中的羥基分子包圍，淀粉酶的水解位點被掩蓋在羥基結(jié)構(gòu)之下，從而導(dǎo)致淀粉酶對淀粉分子無法進行特異性識別所致[22]。與此結(jié)果相似的是，茶多酚也可導(dǎo)致玉米淀粉和馬鈴薯淀粉中的SDS和RS的含量增加[5]。Mojica等[23]研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚類成分對淀粉體外消化性能具有顯著的抑制效果，其作用主要表現(xiàn)在對關(guān)鍵消化酶(α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)活性的抑制效果，也表現(xiàn)為植物多酚對淀粉本身結(jié)構(gòu)的影響[24]。因此，植物多酚類提取物或純多酚與淀粉的共存體系可為開發(fā)預(yù)防和治療Ⅱ型糖尿病的替代品提供參考[25]。

表2 黑豆皮乙醇提取物添加量對大米淀粉回生熱力學(xué)特性及DR值的影響

表3 EBSC添加量對回生大米淀粉體外消化的影響

3 結(jié)論

將富含花青素類物質(zhì)(EBSC)添加到大米淀粉中，其老化度、凝膠強度、回生焓值均顯著降低，說明EBSC對大米淀粉的回生有抑制作用。EBSC的添加顯著提高了大米淀粉的透光率，且添加2.5%的EBSC對大米淀粉的透光率影響較大。此外，EBSC的添加使得大米淀粉的溶解度、膨脹度增大；隨著EBSC添加量的增加，促使大米淀粉的消化體外消化性能下降，RDS含量下降，SDS含量增加。