（云南省林業(yè)和草原科學(xué)院 a.云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.國(guó)家林業(yè)和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201）

云南藍(lán)果樹(shù)Nyssa yunnanensis是云南省特有的極小種群野生植物[1]。目前，已對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)實(shí)施了就地保護(hù)、近地保護(hù)、遷地保護(hù)、種苗繁育和回歸引種等系列的拯救保護(hù)措施，建立了云南藍(lán)果樹(shù)保護(hù)小區(qū)及其保護(hù)管理機(jī)構(gòu)、種苗繁育基地、近地和遷地保護(hù)基地，并進(jìn)行了回歸引種試驗(yàn)示范，使云南藍(lán)果樹(shù)種群得到了較為充分的保護(hù)和恢復(fù)[2-3]。

種苗繁育是云南藍(lán)果樹(shù)拯救保護(hù)的重要環(huán)節(jié)[2]。前期開(kāi)展了云南藍(lán)果樹(shù)種子萌發(fā)特性的研究[4]，可以通過(guò)人工破壞果皮、堿液或赤霉素處理等促進(jìn)其種子萌發(fā)[5]。但是，關(guān)于云南藍(lán)果樹(shù)苗木培育的研究甚少，尤其是苗木生長(zhǎng)過(guò)程中的肥料配比研究仍是空白。另外，云南藍(lán)果樹(shù)的近地保護(hù)、遷地保護(hù)和回歸引種等保護(hù)實(shí)踐的種群監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，云南藍(lán)果樹(shù)苗木移栽后存活率較低，這或許與云南藍(lán)果樹(shù)幼苗抗旱性較差有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)水楊酸浸種處理一定程度上可增強(qiáng)其早期幼苗葉片內(nèi)SOD、POD、CAT 活性、Pro、可溶性糖的含量，降低MDA 含量，進(jìn)而增強(qiáng)其抗旱性[6]。那么，如何進(jìn)行苗期處理進(jìn)而提高云南藍(lán)果樹(shù)苗木的抗旱性，目前未見(jiàn)報(bào)道。

合理施肥可增加植物的抗逆性，是提高作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)的有效途徑[7]。尤其是在水分虧缺的條件下，適當(dāng)施用氮磷鉀肥可提高多種植物葉片中可溶性蛋白、MDA、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶等抗旱性生理指標(biāo)的含量，進(jìn)而提高其抗旱性[8-9]。作為抗旱性較差的云南藍(lán)果樹(shù)，適當(dāng)施肥是否可以促進(jìn)其生理生化性質(zhì)的改變，進(jìn)而提高其在野外的適應(yīng)性，值得研究。

因此，為了建立云南藍(lán)果樹(shù)幼苗最佳施肥技術(shù)方案，本研究根據(jù)農(nóng)業(yè)部《測(cè)土配方施肥技術(shù)規(guī)范（2011 修訂版）》中的“3414”肥料效應(yīng)試驗(yàn)[10-11]，以其生理生化指標(biāo)作為其質(zhì)量控制指標(biāo)，對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)幼苗開(kāi)展施肥效應(yīng)試驗(yàn)，研究不同氮磷鉀施肥對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)幼苗生理指標(biāo)的影響，進(jìn)而確定最佳施肥量，擴(kuò)大云南藍(lán)果樹(shù)種苗繁育規(guī)模，增加苗木培育數(shù)量，用于云南藍(lán)果樹(shù)的種群恢復(fù)與重建。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用云南藍(lán)果樹(shù)苗木為來(lái)自同一個(gè)種源地的1年生容器苗。育苗容器為直徑20 cm 的花盆，培養(yǎng)基質(zhì)為石英砂（3.3 kg）。試驗(yàn)開(kāi)始前先將石英砂在次氯酸鈉（NaClO）中浸泡48 h，洗凈后120℃烘8 h。2017年4月中旬在溫室苗床內(nèi)選擇生長(zhǎng)健壯、苗高相近的云南藍(lán)果樹(shù)幼苗，將其移植入已準(zhǔn)備好的容器內(nèi)。

供施肥料為尿素（含純氮46%N）、磷肥（含12%P2O5）和鉀肥（含60%K2O）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于云南省林業(yè)和草原科學(xué)院溫室中進(jìn)行，自然溫度和自然光照。采用現(xiàn)代肥料二次回歸“3414”試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)氮磷鉀3 個(gè)因素，每個(gè)因素4 水平，共計(jì)14 個(gè)處理，每個(gè)處理10 個(gè)重復(fù)。設(shè)計(jì)中各4 個(gè)因素水平的含義：0 水平指不施肥，2 水平指當(dāng)?shù)刈罴咽┓柿浚? 水平=2 水平×0.5，3 水平=2 水平×1.5（該水平為過(guò)量施肥水平）。分別在7月17日、8月6日和8月26日施肥，試驗(yàn)期間的管理?yè)嵊胧┮恢隆＞唧w的“3414”施肥試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3 取樣與測(cè)定項(xiàng)目及方法

試驗(yàn)結(jié)束前，采集葉片用來(lái)測(cè)定抗旱性相關(guān)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量。本試驗(yàn)選取過(guò)氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、脯氨酸（Pro）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和可溶性蛋白質(zhì)（SP）等植物抗旱性密切相關(guān)的生理指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定。蛋白質(zhì)濃度（SP）的測(cè)定采用BCA（bicinchonininc acid）法；過(guò)氧化物酶活性（POD）的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法[12]；超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用試劑盒（上海生工生物）進(jìn)行測(cè)定；脯氨酸（Pro）含量的測(cè)定采用磺基水楊酸提取法；丙二醛（MDA）含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法（TBA）[13]。

表1 云南藍(lán)果樹(shù)幼苗“3414”肥料試驗(yàn)N、P、K 因素水平Table 1 The levels of N,P and K factors in the “3414” fertilizer efficiency of Nyssa yunnanensis seedlings

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 軟件進(jìn)行回歸分析和作圖，并用SPSS16.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮磷鉀施肥處理對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)幼苗葉片生理指標(biāo)的影響

由表2可知，施肥處理?xiàng)l件下，云南藍(lán)果樹(shù)的各項(xiàng)生理指標(biāo)均高于不施肥處理（N0P0K0）。施肥處理中，以N2P2K1處理的各項(xiàng)生理指標(biāo)最高，其次是N2P1K2、N2P0K2和N2P2K2；綜合各項(xiàng)生理指標(biāo)，最低的為N0P2K2，其次是N2P3K2、N1P1K2和N3P2K2。對(duì)比缺氮（N0P2K2）、缺磷（N2P0K2）、缺鉀（N2P2K0）3 個(gè)處理的生理指標(biāo)，表現(xiàn)為不施肥＜缺氮＜缺鉀＜缺磷，說(shuō)明云南藍(lán)果樹(shù)幼苗對(duì)氮肥的依懶性最強(qiáng)。

2.2 氮、磷、鉀最佳施肥量的確定

以云南藍(lán)果樹(shù)的各項(xiàng)生理指標(biāo)作為因變量，氮磷鉀肥施用量作為自變量進(jìn)行一元二次方程回歸分析，結(jié)果如表3所示。當(dāng)施氮、磷、鉀肥量分別為0.15%～0.18%、0.02%～0.04%和0.08%～0.11%時(shí)，可以保證云南藍(lán)果樹(shù)的生理指標(biāo)最佳。

表2 不同施肥處理對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)幼苗生理指標(biāo)的影響?Table 2 Effects of different fertilization treatments on physiological indicators of Nyssa yunnanensis seedlings

表3 云南藍(lán)果樹(shù)生理指標(biāo)與氮、磷、鉀肥的回歸關(guān)系Table 3 Regression relationship between physiological indicators and fertilizers of Nyssa yunnanensis

2.3 云南藍(lán)果樹(shù)氮磷鉀的互作效應(yīng)對(duì)生理指標(biāo)的影響

2.3.1 磷、鉀肥對(duì)氮肥施用效果的作用

從圖1可知，當(dāng)鉀肥和磷肥施用量為中等水平（K2和P2）時(shí)，除了MDA，云南藍(lán)果樹(shù)幼苗的SP、CAT、POD、SOD、Pro 等生理指標(biāo)均在低氮（N1）處理時(shí)隨施鉀（磷）量的增加而增加，在中氮（N2）處理時(shí)隨施鉀（磷）量的增加而降低。

當(dāng)鉀肥施用量在K2水平時(shí)，N1處理下葉片的SP、CAT、POD、SOD、Pro 隨著施磷量的增加而增加，分別增加了8.24%、27.92%、5.78%、4.87%、4.93%，而MDA 減少了16.61%；在N2處理水平時(shí)，葉片SP、CAT、POD、SOD、Pro 表現(xiàn)為隨著施磷量的增加而減少，分別減少了6.31%、114.16%、25.85%、13.01%、2.08%，MDA 增加了34.41%。當(dāng)磷肥施用量在P2水平時(shí)，在N1處理下葉片的SP、CAT、POD、SOD、Pro 隨著施鉀量的增加而增加，增長(zhǎng)率分別為6.76%、27.55%、16.07%、12.22%、7.17%，MDA 減少了16.61%；在N2處理水平時(shí)，葉片SP、CAT、POD、SOD、Pro 表現(xiàn)為隨著施鉀量的增加而降低，減少率分別為26.83%、121.56%、46.29%、24.86%、8.00%，MDA 增加了37.38%。由此可見(jiàn)，N1水平時(shí)，磷鉀肥的施用對(duì)葉片生理指標(biāo)有影響，中磷、中鉀（P2K2）處理的葉片各項(xiàng)生理指標(biāo)結(jié)果較好，但是差異不顯著；N2水平時(shí)，中磷、中鉀（P2K2）處理的葉片各項(xiàng)生理指標(biāo)結(jié)果較差，在中磷、低鉀（P2K1）水平時(shí)的生理指標(biāo)優(yōu)于其他處理，說(shuō)明中磷、低鉀（P2K1）水平更利于氮肥效果的發(fā)揮。

2.3.2 氮、鉀肥對(duì)磷肥施用效果的作用

如圖2所示，當(dāng)鉀為中等（K2）水平時(shí)，低磷（P1）處理水平的葉片SP、CAT、SOD、Pro 含量隨施氮量的增加而逐漸增加，增長(zhǎng)率分別為27.72%、4.64%、11.27%、2.76%，POD、MDA 含量減少了0.86%、33.36%；中磷（P2）水平時(shí)，隨著施氮量的增加，葉片SP、SOD、Pro 逐漸增加，增長(zhǎng)率為10.99%、11.27%、10.07%，CAT、POD、MDA分別減少4.64%、0.86%、33.36%。

當(dāng)?shù)獮橹械龋∟2）水平時(shí)，低磷（P1）處理的SP、CAT、POD、SOD 和Pro 隨施鉀量的增加而增加，增長(zhǎng)率分別為21.30%、110.49%、35.24%、32.58%、9.05%，MDA 減少了87.21%，而中磷（P2）處理的生理指標(biāo)變化與之相反，即葉片的SP、CAT、POD、SOD、Pro 分別減少了26.83%、121.56%、46.29%、24.86%、8.00%，MDA 增加了37.38%。

因此，氮鉀肥施用對(duì)磷肥的效果不明顯，中氮中鉀（N2K2）水平時(shí)，生理指標(biāo)只在低磷（P1）時(shí)較高，而在中氮低鉀（N2K1）水平時(shí)，中磷水平（P2）下的數(shù)值最高，說(shuō)明中氮低鉀（N2K1）水平利于磷肥效果的發(fā)揮。

圖1 磷、鉀肥對(duì)氮肥施用效果的作用Fig.1 Effects of phosphorus and potassium fertilizer on nitrogen efficiency

圖2 氮、鉀肥對(duì)磷肥施用效果的作用Fig.2 Effects of nitrogen and potassium fertilizer on phosphorus efficiency

續(xù)圖2Continuation of Fig.2

2.3.3 氮、磷肥對(duì)鉀肥施用效果的作用

圖3顯示，氮肥為N2水平時(shí)，隨著施磷量的增加，低鉀（K1）水平處理的葉片SP、CAT、POD、SOD、Pro 含量逐漸增加，分別增長(zhǎng)了44.71%、117.76%、57.20%、46.49%、15.37%，MDA 含量減少了91.35%；而中鉀（K2）水平時(shí)，葉片SP、CAT、POD、SOD、Pro 含量逐漸減少，減少率為6.31%、114.16%、25.85%、13.01%、2.08%，MDA 含量增加了34.41%。

圖3 氮、磷肥對(duì)鉀肥施用效果的作用Fig.3 Effect of nitrogen and phosphorus fertilizer on potassium efficiency

磷肥為中磷水平（P2）時(shí)，隨著施氮量的增加，低鉀（K1）條件下葉片的SP、CAT、POD、SOD、Pro 含量隨之分別增長(zhǎng)了50.29%、184.25%、68.35%、55.92%、18.94%，MDA 含 量 減 少 了113.66%；中鉀（K2）水平時(shí)，葉片BCA、SOD、Pro 含量隨之分別增長(zhǎng)了10.99%、11.27%、2.76%，而CAT、POD、MDA 含量分別降低了4.64%、0.86%、33.36%。在低鉀（K1）水平時(shí)，葉片各生理指標(biāo)在低氮中磷（N1P2）和中氮低磷（N2P1）水平時(shí)變化不大，在中氮中磷（N2P2）水平時(shí)達(dá)到最佳；葉片SP、POD、Pro、SOD 指標(biāo)在中鉀（K2）水平時(shí)，增幅不明顯，說(shuō)明在中氮中磷（N2P2）水平時(shí)利于鉀肥肥效的發(fā)揮（圖3）。云南藍(lán)果樹(shù)在中氮、中磷、低鉀（N2P2K1）水平下的各項(xiàng)生理指標(biāo)表現(xiàn)最佳，說(shuō)明中氮中磷（N2P2）水平有利于鉀肥效果的發(fā)揮。

3 討論與結(jié)論

氮磷鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的重要營(yíng)養(yǎng)元素，影響植物體內(nèi)的一系列生理生化過(guò)程[14]。植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程氮是必需的大量元素之一，氮素水平與植物的酶活性及葉綠素都有密切聯(lián)系。研究表明，適當(dāng)?shù)厥┘拥士梢源龠M(jìn)植物生長(zhǎng)，提高光合速率和抗氧化酶活性。磷元素是植物體內(nèi)的大量元素，主要對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，大量的施肥試驗(yàn)表明磷元素對(duì)植株的生長(zhǎng)、產(chǎn)能提高、品質(zhì)提高具有顯著的作用。鉀元素雖然不直接構(gòu)成生物大分子，但是對(duì)植物體內(nèi)酶的激活有重要作用，且能夠促進(jìn)植物光合作用，是不可缺少的必需元素之一。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在氮磷鉀施肥上做了大量研究，主要集中在肥料配比、生理生化、生長(zhǎng)發(fā)育形態(tài)等三個(gè)方面。任開(kāi)磊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，氮磷鉀肥配比為40:10:100 時(shí)，對(duì)辣木的生長(zhǎng)和產(chǎn)量提高有顯著影響。Nestby 等[16]通過(guò)給藍(lán)莓對(duì)比施肥發(fā)現(xiàn)，氮肥和磷肥配合使用比單獨(dú)施用其中一種肥料更利于產(chǎn)量提高。楊曉清等[17]通過(guò)土沉香水分脅迫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常水分供應(yīng)下，施加適量氮肥利于提高幼苗抗氧化酶活性；水分脅迫下，隨著施氮量的增加，過(guò)氧化氫酶活性顯著增加，過(guò)氧化物酶活性無(wú)明顯變化。李桃楨[18]在研究配比施肥對(duì)刨花潤(rùn)楠幼林的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，施肥處理后葉片的生理指標(biāo)及光合指標(biāo)相對(duì)不施肥均有提高。Maka 等[19]對(duì)長(zhǎng)葉松對(duì)比施肥發(fā)現(xiàn)，氮磷鉀配比施肥比單一施用氮肥顯著提高了幼苗的鮮質(zhì)量和造林成活率，且氮肥和磷肥配施可以增加幼苗高度。當(dāng)植物面對(duì)各種逆境脅迫時(shí)，通過(guò)生理生化過(guò)程對(duì)逆境產(chǎn)生一些適應(yīng)性反應(yīng)[20]。研究表明，適量施肥可降低多種作物的細(xì)胞膜透性，提高葉片中過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性[21]。

本研究結(jié)果顯示，除了MDA 之外，其余測(cè)定指標(biāo)在施肥處理?xiàng)l件下的值均高于不施肥處理（N0P0K0），說(shuō)明施肥總體上可以提高與云南藍(lán)果樹(shù)幼苗抗旱性有關(guān)的SP、CAT、POD、SOD、Pro等生理生化指標(biāo)含量，并降低MDA 的積累，而這些指標(biāo)的變化意味著增強(qiáng)了其幼苗的抗旱性。

植物體內(nèi)的可溶性蛋白（SP）作為植物體中重要的生理生化指標(biāo)，其含量和施肥量密切相關(guān)[14,22]。有研究顯示，植物體內(nèi)可溶性蛋白（SP）含量的積累是有一定閾值的，其含量升高到達(dá)一定限度后，就開(kāi)始降低[23]。在施用不同氮磷鉀肥處理時(shí)，云南藍(lán)果樹(shù)幼苗葉片SP 含量隨著施肥量的增加表現(xiàn)為先增加后降低，證明了云南藍(lán)果樹(shù)幼苗細(xì)胞在適量施肥時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的可溶性蛋白來(lái)抵御外界的環(huán)境變化，保護(hù)幼苗減少受傷害，而當(dāng)?shù)租浄适┯眠^(guò)量時(shí)，將會(huì)影響植物體內(nèi)酶的產(chǎn)生，從而嚴(yán)重減少SP 的合成，對(duì)植物產(chǎn)生有害作用。施肥處理下的整體表現(xiàn)為：不施肥（N0P0K0）＜缺氮（N0P2K2）＜缺鉀（N2P2K0）＜缺磷（N2P0K2），說(shuō)明云南藍(lán)果樹(shù)幼苗SP 含量對(duì)氮肥的依賴性最強(qiáng)，其次是鉀肥和磷肥。氮磷鉀配施時(shí)，N2P2K1水平下的值最高。

丙二醛（MDA）是細(xì)胞受到脅迫后細(xì)胞膜過(guò)氧化作用分解的最終產(chǎn)物，膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，是植物的抗逆性指標(biāo)，含量越多說(shuō)明植物受到的活性氧毒害越嚴(yán)重[24]。配比施肥合理時(shí)，植物葉片丙二醛含量會(huì)逐漸減少[25-27]。試驗(yàn)結(jié)果中，對(duì)照組（不施肥）處理葉片中的MDA 含量最高；N2P2K1施肥水平時(shí)，植物葉片中的MDA含量最低。當(dāng)施肥濃度及配比高于或低于植物最佳施肥量時(shí)，葉片細(xì)胞膜通透性增大，MDA 含量增加。同樣地，MDA 對(duì)氮磷鉀肥的依賴程度類似于SP 含量。

超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）是植物細(xì)胞中主要承擔(dān)清除活性氧的保護(hù)酶，在逆境下維持其較高的生物活性，能夠使植物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性[7]。研究表明SOD、POD 和CAT 酶活性的高低是植物抗旱性的重要標(biāo)志[6,28]。游離脯氨酸（Pro）是植物體內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)[29]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，施肥處理的植物葉片SOD、POD、CAT 酶活性和Pro 含量均高于不施肥處理，各組之間差異顯著，且隨著施肥量的增加，測(cè)定指標(biāo)含量表現(xiàn)為先增加后降低，氮磷鉀配比適量施肥（N2P2K1）時(shí)最高，表明適量施肥可以促進(jìn)云南藍(lán)果樹(shù)呈現(xiàn)最優(yōu)的生理生化變化。

前期研究發(fā)現(xiàn)，云南藍(lán)果樹(shù)幼苗抗旱性較差是導(dǎo)致其天然更新困難的原因[30]。水分脅迫條件下，云南藍(lán)果樹(shù)葉片的SOD、POD、CAT 活性、Pro、可溶性糖含量顯著降低，而MDA 含量顯著升高[6]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適量施肥可提高植物本身的抗旱性生理指標(biāo)，進(jìn)而間接地增強(qiáng)其抗旱性，促進(jìn)天然更新。本試驗(yàn)首次采用農(nóng)業(yè)部推薦的“3414”施肥方法對(duì)云南藍(lán)果樹(shù)苗木培育技術(shù)開(kāi)展研究。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以將試驗(yàn)結(jié)果用函數(shù)擬合，推算出最佳施肥量。本研究通過(guò)擬合一元二次方程，得出當(dāng)施氮、磷、鉀肥量分別為5.28、0.99和2.97 g/株時(shí)，可以保證云南藍(lán)果樹(shù)的生理指標(biāo)最佳，為云南藍(lán)果樹(shù)苗木培育提供了理論依據(jù)。然而，氮磷鉀肥三者不僅在云南藍(lán)果樹(shù)幼苗的各項(xiàng)生理指標(biāo)中發(fā)揮著各自的作用，同時(shí)，氮磷鉀肥效的發(fā)揮還受三者彼此間互作的影響。本研究結(jié)果顯示，中磷低鉀（P2K1）水平更利于氮肥效果的發(fā)揮，中氮低鉀（N2K1）水平利于磷肥效果的發(fā)揮，中氮中磷（N2P2）水平有利于鉀肥效果的發(fā)揮。