[遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院口腔頜面外科，廣東 珠海 519100]

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是口腔頜面部常見的唾液腺惡性腫瘤，目前治療方法仍以手術(shù)為主，輔以放化療。順鉑是治療腺樣囊性癌常見的化療藥物，然而，它的應(yīng)用受到耐藥性和副作用的限制。因此，開發(fā)與順鉑協(xié)同作用并減少副作用的新藥物具有重要意義。研究表明，姜黃素聯(lián)合順鉑在多種腫瘤中發(fā)揮協(xié)同作用[1-2]。本研究探討姜黃素聯(lián)合順鉑對腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞的抗腫瘤作用及其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-elF2α、CHOP、p-JNK蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 ACC-M細(xì)胞株購自廣州華拓生物科技有限公司，姜黃素(Curcumin,Cur)、順鉑(cisplatin,DDP)、胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)均購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司(批號：458-37-7、批號：15663-27-1、批號：15140-122、批號：67-68-5)、RPMI-1640均購自美國Gibco公司(批號：15140-122)，MTT試劑盒(批號：C0009S)、LDH試劑盒購自江蘇碧云天生物科技研究所(批號：C00016)、GRP78(批號：#3177)、p-elF2α(批號：#3398)、elF2α(批號：#5324)、CHOP(批號：#2895)、p-JNK(批號：#9255)、GAPDH(批號：#5174)均購自美國CST公司,鼠源二抗、兔源二抗購自美國CST公司(批號分別為：#7076、#7074)。酶標(biāo)儀購自美國ThermoScientific公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購自力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)，96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corstor公司(型號：3300)，電子天平購自德國艾科勒公司(型號：ALC-210.4)。尼康ECKIPSE TS100/TS100倒置顯微鏡購自Nikon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng) 將ACC-M細(xì)胞分為姜黃素組、順鉑組、聯(lián)合用藥組、對照組，用實(shí)驗(yàn)筆標(biāo)記分組名稱、時(shí)間。將ACC-M細(xì)胞置于含10%胎牛血清及1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進(jìn)行傳代，待細(xì)胞貼壁后取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法測定細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的ACC-M細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/毫升，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，然后分組給藥。實(shí)驗(yàn)分組如下：對照組：加入0.1% DMSO；順鉑組(DDP組)：加入DDP(8 μM)，姜黃素組：Cur(5 μM、10 μM、20 μM、40 μM)；聯(lián)合用藥組：不同濃度(5 μM、10 μM、20 μM、40 μM)Cur聯(lián)合DDP(8 μM)。加藥處理24 h后棄上清，每孔加入1 mg/ml的MTT溶液100 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸去上清，每孔加入100 μl的DMSO，選擇495 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=(藥物干預(yù)組OD值-空白組OD/對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 LDH法測定細(xì)胞毒性 ①按實(shí)驗(yàn)分組給藥，取上清液，400 g離心5 min，每組分別取120 μl置于96孔板；②配置INT溶液：將10×INT溶液稀釋至×1。按酶溶液∶INT溶液∶乳酸溶液=1∶1∶1比例配置LDH工作液，避光放置；③每組加入60 μl LDH工作液，混勻，室溫避光孵育30 min，490 nm測定每組吸光度。計(jì)算公式：LDH釋放量(%)=(處理組樣品OD值-處理組對照孔OD值)/(空白組樣品OD值-空白組對照孔OD值)×100%。

1.5 倒置顯微鏡下觀察用藥后各組細(xì)胞生長情況 取對數(shù)生長期的ACC-M 細(xì)胞，接種于6孔板中過夜，在姜黃素組、順鉑組、聯(lián)合用藥組中分別加入20 μmol/L姜黃素、8 μmol/L順鉑、20 μmol/L姜黃素+8 μmol/L順鉑進(jìn)行干預(yù)，對照組中加入0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，作用24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法測定 GRP78、p-elF2α、CHOP、p-JNK 蛋白的表達(dá) 倒置顯微鏡下觀察各種細(xì)胞形態(tài)后，分組加入細(xì)胞裂解液，4℃離心，12 000 r/min,離心5 min，吸取上清，測定蛋白濃度，使每孔上樣蛋白總量均一化(20 μg)，然后在10%SDS-PAGE凝膠上分離，轉(zhuǎn)膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后孵育目的蛋白GRP78、p-elF2α、CHOP和p-JNK一抗(1∶1000稀釋)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，4℃孵育過夜；震蕩洗膜3次，孵育二抗，4℃孵育2 h；最后采用Bio-Rad凝膠處理系統(tǒng)采集結(jié)果，圖片并用image J軟件對結(jié)果進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素聯(lián)合順鉑對ACC-M細(xì)胞的細(xì)胞存活率和LDH釋放量的影響 用不同濃度的姜黃素單獨(dú)或聯(lián)合處理ACC-M細(xì)胞24 h，MTT實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞存活率，收集上清液測定LDH釋放量。結(jié)果表明：見圖1，用8 μM順鉑作用細(xì)胞24 h后，與對照組相比，ACC-M細(xì)胞存活率明顯降低(見圖1A)；用不同濃度的Cur(5 μM、10 μM、20 μM、40 μM)聯(lián)合DDP(8 μM)處理ACC-M細(xì)胞，與DDP組相比，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低(P<0.05)；在LDH釋放量得到類似的結(jié)果，其中Cur能顯著增加由DDP引起的LDH釋放量(見圖1B)。本實(shí)驗(yàn)采用金正均法判斷兩種藥是否存在協(xié)同作用，Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)，當(dāng)Q值>1.15時(shí)，說明具有協(xié)同增效作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)8 μM 順鉑與10 μM姜黃素聯(lián)用時(shí)，計(jì)算Q值為1.24，表明兩者存在協(xié)同作用；當(dāng)8 μM 順鉑與20 μM姜黃素聯(lián)用時(shí)，計(jì)算Q值為1.18，表明兩者存在協(xié)同作用；其余各組Q值為0.95～1.06，見表1。

注：與空白組比較，#：P<0.05；與順鉑組比較，*：P<0.05；Ctrl：空白對照；DDP：順鉑；Cur：姜黃素。

表1 不同濃度聯(lián)合用藥作用24 h后對ACC-M細(xì)胞Q值的影響

2.2 姜黃素聯(lián)合順鉑作用24 h后對ACC-M細(xì)胞生長情況的影響 各組細(xì)胞在加藥后24 h，倒置顯微鏡下觀察，對照組ACC-M細(xì)胞呈梭形，胞質(zhì)較為豐富，細(xì)胞核位于中央。而加入姜黃素(20 μM)、順鉑(8 μM)后，細(xì)胞由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核往邊上移動，但細(xì)胞膜尚完整。同時(shí)，細(xì)胞貼壁數(shù)量減少，脫落漂浮于培養(yǎng)液的細(xì)胞增多，尤其在聯(lián)合用藥組(20 μM Cur+8 μM DDP)，細(xì)胞貼壁細(xì)胞明顯減少，而脫落于培養(yǎng)液的細(xì)胞明顯增多。見圖2。

注：黑色色箭頭代表貼壁ACC-M細(xì)胞，紅色代表死亡ACC-M細(xì)胞；Control：空白對照；DDP：順鉑；Cur：姜黃素。

2.3 姜黃素與順鉑單獨(dú)及聯(lián)合使用對ACC-M細(xì)胞GRP78、p-elF2α、CHOP、p-JNK蛋白表達(dá)水平的影響 使用8 μM的DDP和20 μM Cur單獨(dú)或聯(lián)合處理ACC-M細(xì)胞24 h后，收集蛋白檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-elF2α、elF2α、p-JNK和內(nèi)參蛋白GAPDH的表達(dá)。與空白對照組相比，8 μM DDP處理24 h后，DDP組的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-elF2α、CHOP上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；20 μM Cur聯(lián)合DDP(8 μM)處理24 h后，GRP78、p-elF2α、CHOP、p-JNK蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明姜黃素能進(jìn)一步增強(qiáng)由順鉑誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，見圖3。

注：與空白組比較，#P<0.05；與順鉑組比較，*P<0.05；Control(空白對照)，DDP(順鉑)，Cur(姜黃素)，Combination(聯(lián)合用藥)。

3 討論

SACC是頜下腺和舌下腺最常見的上皮性涎腺惡性腫瘤，占腮腺惡性腫瘤的7%～18%，占小涎惡性腫瘤的35%～58%。SACC可發(fā)生在所有年齡段，在50～60歲中老年患者中出現(xiàn)頻率更高，臨床上以神經(jīng)浸潤和多發(fā)性局部復(fù)發(fā)為特征[3-4]。目前，SACC的治療以手術(shù)為主，即使進(jìn)行根治性手術(shù)治療，5～10年的復(fù)發(fā)率仍較高[5]，所以目前多主張術(shù)后輔以放化療。術(shù)后放療被認(rèn)為可以局部控制腫瘤進(jìn)展，但5年后復(fù)發(fā)率仍可達(dá)到一半[6]。此外，即使局部控制的病人仍可能在輻射場外或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)，術(shù)后輔以化療越來越得到研究者的認(rèn)可。順鉑是治療癌癥的傳統(tǒng)一線化療藥物[7-8]，其可以誘導(dǎo)DNA-蛋白質(zhì)以及鏈間和鏈內(nèi)DNA交聯(lián)，盡管這種交聯(lián)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖，但是順鉑的有效性受到細(xì)胞耐藥性及毒性的限制，包括遺傳毒性、腎毒性和急性骨髓毒性[9-10]。為了減少順鉑的耐藥及其毒副作用，增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤效果，臨床上常將順鉑與其他藥物聯(lián)合使用，中藥因其藥理作用廣，同時(shí)毒副作用小而成為理想選擇。

姜黃素是從姜黃根莖中提取的脂溶性多酚類衍生物，具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等多方面的藥理作用[11-13]。在膀胱癌細(xì)胞系中，與單獨(dú)使用姜黃素或順鉑相比，10 μM姜黃素和10 μM順鉑聯(lián)合使用可明顯降低膀胱癌細(xì)胞系的生存能力，促使其調(diào)亡明顯增加[14]。Zhu X等[15]發(fā)現(xiàn)，與單純順鉑相比，姜黃素和順鉑聯(lián)合應(yīng)用可通過調(diào)節(jié) Twist1上調(diào) miR-186表達(dá)，增強(qiáng)順鉑對卵巢癌的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)MTT及LDH試驗(yàn)結(jié)果顯示，與單獨(dú)順鉑組相比，姜黃素聯(lián)合順鉑可明顯抑制ACC-M細(xì)胞增殖，增強(qiáng)順鉑對ACC-M細(xì)胞毒性，姜黃素聯(lián)合順鉑具有較好的協(xié)同作用，姜黃素可增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤效果。

生理或病理?xiàng)l件下的多種刺激可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的積累，這將激活一種進(jìn)化上保守的適應(yīng)性反應(yīng)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，如果刺激嚴(yán)重或持續(xù)，則會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16-17]。葡萄糖調(diào)節(jié)反應(yīng)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)又稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein，Bip)，正常情況下，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)三種跨膜蛋白(蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(RNA dependent protein kinase-like ER kinase，PERK)、肌醇需求酶 1(inositol requiring enzyme 1-α，IRE1α) 和活化轉(zhuǎn)錄因子6 (activating transcription factor 6-α，ATF6α)結(jié)合并使其失活。發(fā)生ERS時(shí)，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白與GRP78 /Bip的親和力較高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)GRP78表達(dá)增加[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用姜黃素或聯(lián)合順鉑處理后，ACC-M細(xì)胞中GRP78表達(dá)增加，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活，而聯(lián)合用藥后細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)增加明顯，表明姜黃素聯(lián)合順鉑可增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。PEAK通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)一條重要的信號通路，據(jù)報(bào)道其與多種腫瘤的增殖及存活有關(guān)，通過靶向PEAK信號通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬被認(rèn)為是一個新的治療策略[19]。在這項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合順鉑作用后ACC-M細(xì)胞內(nèi)p-eIF2α表達(dá)上調(diào)，提示姜黃素聯(lián)合順鉑可能通過PERK /eIF2α信號通路激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

CHOP蛋白又稱為生長抑制DNA損傷基因153(growth arrest and DNA damage-inducible gene 153，GADD 153)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激三條信號通路均能誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)。ATF6、ATF4或XBP1S表達(dá)上調(diào)通過與CHOP基因啟動子內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們的研究表明姜黃素或順鉑通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以激活A(yù)CC-M細(xì)胞內(nèi)CHOP的表達(dá)，且聯(lián)合用藥后細(xì)胞內(nèi)CHOP表達(dá)明顯增加，表明姜黃素聯(lián)合順鉑通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的CHOP信號通路從而誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡。目前，CHOP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的下游機(jī)制仍在探索之中。其可介導(dǎo)Bcl-2下調(diào)和Bim上調(diào)，還可誘導(dǎo)促凋亡蛋白ERO1α和Puma的表達(dá),持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終導(dǎo)致線粒體功能障礙、細(xì)胞色素c釋放和caspase-3活化[20]。白亮等[21]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素作用腺樣囊性癌后，細(xì)胞內(nèi)caspase-3明顯增加，其認(rèn)為將姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與caspase-3有關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合順鉑作用后細(xì)胞內(nèi)CHOP蛋白明顯增加，因而我們認(rèn)為姜黃素可能通過誘導(dǎo)CHOP表達(dá)而激活下游的caspase-3表達(dá)，而誘發(fā)ACC-M細(xì)胞凋亡。

JNK同樣是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起重要的調(diào)控作用。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，IRE1α信號通路激活，其可通過刺激凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulaing kinase-1，ASK1)的激活，而后者可引起應(yīng)激激酶Jun-N-末端激酶(JNK)下游激活，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡[22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素作用24 h后，ACC-M細(xì)胞內(nèi)p-JNK增加，順鉑組p-JNK變化不明顯，而聯(lián)合組p-JNK蛋白表達(dá)大于單藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明姜黃素聯(lián)合順鉑可通過介導(dǎo)P-JNK誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞凋亡。

綜上所述，姜黃素聯(lián)合順鉑可對ACC-M細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，其機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。姜黃素聯(lián)合順鉑可通過誘發(fā)ACC-M細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)增加，可能通過活化PEAK-elF2α及IRE1α信號通路,進(jìn)而促進(jìn)CHOP及JNK介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。姜黃素屬于多靶點(diǎn)的生物活性藥物，其聯(lián)合順鉑對ACC的抗腫瘤作用機(jī)制是否還有其它信號通路，有待于進(jìn)一步的研究。