孫文文，柯紅利，阿周存

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

生精障礙是男性不育最常見病因，在其發(fā)病過程中，遺傳因素起著重要作用〔1〕。目前，已發(fā)現(xiàn)一些生精障礙的遺傳病因，但這些已知的遺傳病只能解釋一小部分病例，仍有大量的相關(guān)基因有待進(jìn)一步闡明〔2〕。作為一類基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，MicroRNA（miRNA）通過與靶mRNA 的3′-UTRs堿基配對形成雙鏈，介導(dǎo)靶mRNA 裂解或抑制mRNA 翻譯形成蛋白質(zhì)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔3〕。研究表明，miRNA 參與精子發(fā)生過程中許多基因轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控，其異?？赡軐?dǎo)致生精障礙〔4-6〕。因此，miRNA 基因也被認(rèn)為是一類新的生精障礙候選基因，研究鑒定生精障礙相關(guān)的miRNA 基因，對生精障礙遺傳病因的闡明具有重要意義。

miR-27a和miR-605基因是近些年來發(fā)現(xiàn)的與哺乳動物和人類精子發(fā)生密切相關(guān)的miRNA 基因，也被認(rèn)為是生精障礙和男性不育的重要候選基因〔7-9〕。目前，尚未有miR-27a和miR-605基因的多態(tài)性與嚴(yán)重生精障礙的研究報(bào)道。本研究在正常男性和嚴(yán)重生精障礙患者中，對miR-27a和miR-605基因內(nèi)的常見單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)rs895819 和rs2043556 的多態(tài)性分布進(jìn)行分析和比較，從基因變異的角度，初步探索miR-27a和miR-605基因與嚴(yán)重生精障礙的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象病例組由318例嚴(yán)重生精障礙患者組成，包括嚴(yán)重少精癥（精子密度小于5×106個∕mL）患者和無精癥患者，病例來自于四川大學(xué)華西醫(yī)院和大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院。對照組包括234例精子密度正常的男性。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器DNA提取試劑盒（TIANGEN公司，批號：DP304）；dNTPs（TaKaRa公司，批號：AJ30388A）；PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司）；Taq DNA聚合酶（TaKaRa 公司，批號：DR001AM）；限制性內(nèi)切酶DraⅢ和HinfI（Thermo Fisher 生物公司，批號：ER1231、ER0801）；PCR 擴(kuò)增儀（Eppendorf 公司，型號：AG 22331 Hamburg）；凝膠電泳儀（Bio-RAD 公司，型號：041BR）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-RAD 公司，型號：Gel Doc100）。

1.3 方法

1.3.1 PCR 擴(kuò)增 用DNA 提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）從200 μL 外周血中提取基因組DNA。miR-27a和miR-605的PCR 擴(kuò)增引物序列、擴(kuò)增片段長度、退火溫度見表1。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的體積為25 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)（94 ℃變性30 s，57～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），最后72 ℃延伸5 min。

表1 PCR擴(kuò)增的引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物大小，RFLP分析所用的限制性內(nèi)切酶和等位基因的酶切片段長度

1.3.2 基因分型 利用限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析方法對SNP rs895819和rs2043556進(jìn)行基因分型。取PCR 產(chǎn)物10 μL，用10 個單位的限制性內(nèi)切酶消化過夜，然后在2%（rs895819）和3%（rs2043556）的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。所用的限制性內(nèi)切酶、各等位基因的酶切片段見表1。通過對部分不同基因型的部分標(biāo)本進(jìn)行PCR 產(chǎn)物直接測序，對電泳分型結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)數(shù)計(jì)算基因頻率和基因型頻率。用HWE 計(jì)算器進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)比較病例組和對照組之間等位基因和基因型頻率之間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果

miR-27a基因的SNP rs895819 等位基因頻率和基因型頻率分布在嚴(yán)重生精障礙患者和正常男性之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；miR-605基因的SNP rs2043556 等位基因頻率和基因型頻率分布在嚴(yán)重生精障礙患者和正常男性間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，嚴(yán)重生精障礙患者中rs2043556 的等位基因C 的頻率（36.2%vs.29.1%，P=0.013，OR=1.383，95%CI為1.070～1.788）和帶有等位基因C 的個體（TC∕CC）的頻率（57.2%vs.48.3%，P=0.037，OR=1.433，95%CI為1.021～2.012）顯著高于正常男性，而TT 基因型的頻率（42.8%vs.51.7%，P=0.037，OR=0.698，95%CI為0.497～0.980）則顯著低于正常男性。見表2。

表2 對照組和病例組SNP rs895819 和rs2043556的等位基因頻率和基因型頻率分布

Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，SNP rs895819 和rs2043556 的基因型分布在嚴(yán)重生精障礙患者和正常男性中符合Hardy-Weinberg 平衡，提示本研究的研究對象具有群體代表性。

SNP rs895819 和rs2043556 的電泳分型結(jié)果與測序結(jié)果一致，表明本研究RFLP 分型的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。見圖1。

圖1 SNP rs895819和rs2043556的電泳分型結(jié)果

3 討論

本研究對生精障礙的候選基因miR-27a和miR-605的常見SNP rs895819 和rs2043556 的多態(tài)性與嚴(yán)重生精障礙的相關(guān)性進(jìn)行了調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示，miR-27a基因的SNP rs895819 的等位基因頻率和基因型頻率分布在嚴(yán)重生精障礙患者和正常男性間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示SNP rs895819 的多態(tài)性與嚴(yán)重生精障礙不相關(guān)。然而，在miR-605基因的SNP rs2043556位點(diǎn)上，嚴(yán)重生精障礙患者的等位基因C 頻率和帶有等位基因C 的個體（TC∕CC）的頻率顯著高于正常男性，基因型TT的頻率則顯著低于正常男性。這些結(jié)果表明，SNP rs2043556的多態(tài)性與嚴(yán)重生精障礙相關(guān)聯(lián)，基因型TT是嚴(yán)重生精障礙的保護(hù)性基因型（降低發(fā)病風(fēng)險），而等位基因C可能增加嚴(yán)重生精障礙的發(fā)病風(fēng)險。

上述結(jié)果顯示，SNP rs2043556 影響嚴(yán)重生精障礙的發(fā)病風(fēng)險，但具體原因尚未清楚。SNP rs2043556 是一個位于pre-miR-605結(jié)構(gòu)區(qū)域的C∕T變異。該變異影響轉(zhuǎn)錄后pre-miR-605的加工效率，進(jìn)而影響成熟miR-605的表達(dá)水平。與等位基因T 相比，等位基因C 的miR-605表達(dá)水平顯著降低〔10〕。有研究顯示，miR-605能在mRNA 水平和蛋白水平抑制靶基因MDM2表達(dá)，其表達(dá)水平降低將導(dǎo)致MDM2過表達(dá)〔10-12〕。MDM2基因是一個在生精過程中發(fā)揮重要作用的基因，其過表達(dá)可能會對正常的生精功能造成較大的影響，導(dǎo)致生精障礙，如無精癥和嚴(yán)重少精癥〔13-14〕。因此，SNP rs2043556通過影響miR-605的表達(dá)水平，進(jìn)而引起miR-605一些在生精過程中有重要作用的靶基因的表達(dá)異常，最終影響正常的生精功能，導(dǎo)致生精障礙。這可能是SNP rs2043556 影響嚴(yán)重生精障礙發(fā)病風(fēng)險的原因之一。

本研究首次對miR-27a和miR-605基因的常見SNP rs895819 和rs2043556 多態(tài)性與嚴(yán)重生精障礙的關(guān)系進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)miR-605的SNP rs2043556的多態(tài)性與嚴(yán)重生精障礙相關(guān)，其變異影響嚴(yán)重生精障礙的發(fā)病風(fēng)險，提示miR-605可能參與生精障礙的病理過程。研究結(jié)果有可能為生精障礙的遺傳病因?qū)W提供有價值的參考。