錢胡蕊，朱國平，2，3，4

（1.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；2.上海海洋大學極地研究中心，上海 201306；3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室極地海洋生態(tài)系統(tǒng)研究室，上海海洋大學，上海 201306；4.國家遠洋漁業(yè)工程技術研究中心，上海海洋大學，上海 210306）

南極鱷冰魚科為南大洋魚類中獨特且重要的組成部分。鱷冰魚科是許多陸架水域魚類生物量的主要組成部分［1］，其中裘氏鱷頭冰魚（Champsocephalus gunnari）和南極小帶腭魚（Cryodraco antarcticus）為該科具有商業(yè)價值的魚種，尤其是裘氏鱷頭冰魚。裘氏鱷頭冰魚商業(yè)性開發(fā)始于1976年，年漁獲量曾超過50萬t，而雪冰屬（Chionobathyscus）和小帶腭魚屬（Cryodraco）則是鱗頭犬牙南極魚（Dissostichus mawsoni）延繩釣漁業(yè)的主要兼捕魚種［2］。裘氏鱷頭冰魚為南極季節(jié)性浮冰區(qū)及其以北島嶼近海魚類區(qū)系的重要魚種，棲息水深為100 ～350 m，它是南極鱷冰魚科的典型代表，與其他冰魚有著相似的生活史特征，如卵較大，繁殖力較低，生長較快等［3］。南極小帶腭魚與頭帶冰魚（Chaenocephalus aceratus）關系較近，在深水區(qū)和南極高緯海區(qū)生態(tài)功能取代了頭帶冰魚［4］。盡管分布廣泛，但與裘氏鱷頭冰魚相比，關于南極小帶腭魚生物學方面的信息極為有限［5］。鑒于目前有關兩個魚種的生物學研究相對較少，尤其是南極小帶腭魚，因此開展相關研究顯得尤為必要。

魚類的耳石形態(tài)、大小、功能和微結構特征隨種類而存在差異，耳石的結構與組成相當穩(wěn)定，可反映魚類的生長情況及其一生所經歷的環(huán)境變化［6］。耳石形態(tài)分析是一種有效的種群識別方法，它與遺傳異質性和環(huán)境因素對耳石形態(tài)的影響有關［7］。裘氏鱷頭冰魚與南極小帶腭魚的耳石外型特征十分相似，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學測量法無法區(qū)分兩者之間的差異。傳統(tǒng)的耳石外型分析通常采用逐步判別分析法（stepwise discriminantanalysis，SDA），但該方法在處理大數據和多變量時有所不足。最近，作為一種多元統(tǒng)計手段，主成分分析（principal component analysis，PCA）也應用到魚類耳石外型的分析中，其主要的優(yōu)點在于可以對多個變量進行降維處理，對分類變量無先驗性假設［8-9］。而隨機森林（random forest，RF）作為一種機器學習方法，通過對大量分類樹的匯總提高了模型的預測精度，運算速度較快，在處理大數據時表現優(yōu)異。隨機森林不需要顧慮一般回歸分析面臨的多元共線性問題，無需進行變量選擇。另外，隨機森林便于計算變量的非線性作用，且可體現變量間的交互作用［10］，并對離群值不敏感。為此，本研究利用主成分分析、逐步回歸分析以及隨機森林分析對兩種冰魚的耳石外型特征進行比較研究，探討矢耳石各形態(tài)學參數與魚體生長關系，建立耳石各形態(tài)學參數與魚體體長關系的函數模型，以期為裘氏鱷頭冰魚及南極小帶腭魚耳石形態(tài)學提供基礎數據，并對4種方法進行比較分析，以為基于耳石形態(tài)的種群鑒別及年齡鑒定提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料來源

裘氏鱷頭冰魚和南極小帶腭魚樣本分別采集于2016年2月和2018年3月，采集海域為南極半島水域（57°43′W ～61°49′W、60°18′S～63°42′S）和南奧克尼群島（46°18′W、60°12′S）。樣本采集后冷凍保存，待運回實驗室后開展后續(xù)分析。

在實驗室中解凍樣本，測量體長（SL）、體質量（TW）等生物學數據后，取出耳石，其中體長的測量精度為0.1 cm；體質量測量精度為0.1 g。本次實驗選取裘氏鱷頭冰魚共98尾，取得完整左耳石96枚，右耳石98枚；選取南極小帶腭魚共41尾樣本，取得完整左耳石41枚，右耳石41枚。對兩種冰魚的右耳石進行質量測量及圖像采集（表1）。

表1 兩種南極冰魚樣本信息Tab.1 Sample information of Champsocephalus gunnari and Cryodraco antarcticus

1.2 耳石處理

將魚體內取出的耳石用超純水沖洗表面污垢黏液，再用超聲波清洗機進行清洗，干燥后放入離心管常溫保存。利用分度值為0.001 mg的微量分析天平稱取干燥后耳石的質量（OW），并將耳石移至OLYMPUSSZ61型解剖鏡下，耳石凸面向上、凹面向下放置，進行圖像拍照采集。通過Digimizer圖像測量軟件，分別測量4個耳石形態(tài)參數值：耳石長（otolith length，OL）、高（otolith height，OH）、周長（otolith perimeter，OP）、面積（otolith area，OA），測量結果精確至0.001 mm。各形態(tài)參數測量位置如圖1所示。

1.3 研究方法

1.3.1 傳統(tǒng)形態(tài)學測量

參考AGüERA和BROPHY［11］、王英?。?2］以及魏聯(lián)等［13］的相關研究，首先對兩種魚類耳石進行5個尺寸參數的測量，再通過公式的轉換得到7個耳石形狀指標數據（表2）。形態(tài)因子表述耳石輪廓的規(guī)則程度，其值越大，耳石輪廓越趨于規(guī)則；橢圓率描述外緣點到長、短軸間的距離是否成比例關系；幅形比表示耳石長軸與短軸間的差異程度，幅形比越接近1，說明差異越小。利用測量的尺寸參數及得到的形態(tài)指標對兩種不同冰魚耳石的形態(tài)學數據進行t檢驗并進行對比分析。

圖1 南極小帶腭魚（a）和裘氏鱷頭冰魚（b）右耳石測量及形態(tài)示意圖Fig.1 Schematicmap of otolith morphology and measurements of Cryodraco antarcticus and Champsocephalus gunnari

表2 兩種冰魚耳石尺寸參數和形狀指標Tab.2 Size parameters and morphological indices of otoliths for two icefishes

1.3.2 橢圓傅里葉測量

考慮到橢圓傅里葉分析方法可以描繪具有閉合二維輪廓的任何類型的形狀［14］，因此，本研究采用該方法對兩種冰魚的耳石外型進行再處理，利用得到的傅里葉諧值進行判別分析。具體處理過程參見KUHL和GIARDINA［15］。利用Shape 1.3軟件包的PrinComp獲得傅里葉諧值。每個耳石共由80個傅里葉特征系數（諧值）進行描述，對80個傅里葉諧值進行標準化后，考慮到前3個系數均為定值，故研究中采用77個傅里葉諧值進行統(tǒng)計分析，用于后續(xù)主成分分析、逐步判別分析和隨機森林分析。

1.4 數據處理

針對測量得出的5項耳石形態(tài)學參數和7項形狀指標，利用Shapiro-Wilk（S-W）檢驗其是否符合正態(tài)分布。若符合，則利用配對樣本t檢驗分析其差異性；若不符合，則利用Kolmogorov-Smirnov（K-S）檢驗和Wilcoxon符號秩檢驗。分析耳石各個形態(tài)學參數值與體長之間的函數關系，并利用赤池信息準則（AIC）選取最適擬合函數，AIC值最小者為最適合函數［16-17］。

對77個傅里葉諧值進行PCA分析，再利用SDA對兩種冰魚進行判別分析，選出納入判別方程的因子，建立判別方程，求得正確率［18］。為了對比傳統(tǒng)的SDA分析，減少形狀描述符的維數和避免形狀描述符之間的共線性，本研究同時利用基于隨機森林的判別方法對PCA中貢獻率最高的前10個成分進行深入學習。采取70%作為訓練樣本，30%作為預測樣本，分類樹為100。外型統(tǒng)計分析以及SDA均采用SPSS 19.0軟件操作，PCA 和 RF 分別利用 R 4.0.0 程序中的FactoMineR和RandomForest包實現。除特殊說明外，顯著性水平均取P=0.05。

2 結果與分析

2.1 耳石形態(tài)測量數據分析

2.1.1 耳石尺寸參數與體長的關系

通過觀察發(fā)現，兩種魚類耳石的基葉、翼葉均分化明顯，基葉和翼葉之間的主間溝清晰。南極小帶腭魚耳石外形趨近于矩形，耳石邊緣較光滑平整，背部和腹部均無明顯突起，耳石上無明顯缺刻。裘氏鱷頭冰魚耳石外型趨近于圓形，耳石背部分布較多不平坦的缺刻，部分個體耳石前部溝壑內有分化的突起，常稱為耳石中央突。

兩種冰魚耳石在個體較小時均趨近圓形，且隨著體長的增加，南極小帶腭魚和裘氏鱷頭冰魚耳石的基葉、翼葉分化愈明顯。K-S檢驗顯示，兩種冰魚5個耳石形態(tài)參數均存在顯著性差異（表3）。

通過AIC檢驗選取兩種冰魚體長和5項耳石形態(tài)學參數之間的最適函數。配對樣本Wilcoxon符號秩檢驗顯示，耳石長、高、周長、面積和質量擬合出的兩種冰魚函數體長與實際測量體長無顯著差異（P＞0.05），兩種冰魚的耳石各形態(tài)學參數均可用于預測這兩種冰魚的體長（表4）。同時，通過對數函數關系可以看出，南極小帶腭魚的耳石大小會隨體長、年齡的增長而增大，但至生長后期，耳石的增長速度逐漸減緩。

2.1.2 耳石形狀指標

通過視覺觀察可以看出，裘氏鱷頭冰魚耳石形狀更為規(guī)則，趨近于圓，耳石背部分布較多不平坦的缺刻，部分個體耳石前部溝壑內有分化的突起。南極小帶腭魚耳石長、短軸相近，趨近于方形，耳石邊緣比較光滑平整，背部和腹部均無明顯突起，耳石上無明顯缺刻。K-S檢驗顯示，兩種冰魚耳石的矩形趨近率、圓度和面密度均無顯著差異，說明兩種冰魚耳石的輪廓形狀和耳石厚度極為相似，僅從外觀上無法判別耳石種類。雖然描述兩種冰魚耳石的形態(tài)因子、橢圓率及幅形比等3項形狀指標存在著極顯著性差異（P＜0.01），但直觀上的外型觀察（均值和標準差）仍不明顯（表5）。因此，通過視覺觀察和傳統(tǒng)的形態(tài)學測量法并不能有效地區(qū)分兩種冰魚耳石特征差異。

表3 裘氏鱷頭冰魚和南極小帶腭魚耳石尺寸參數比較Tab.3 Comparison on otolith morphology of Champsocephalus gunnari and Cryodraco antarcticus

表4 裘氏鱷頭冰魚和南極小帶腭魚體長與耳石形態(tài)參數間的函數關系Tab.4 Functional relationship between otolith morphology and standard length of Champsocephalus gunnari and Cryodraco antarcticus

表5 裘氏鱷頭冰魚和南極小帶腭魚耳石形狀指標參數比Tab.5 Comparison on otolith morphological indices of Champsocephalus gunnari and Cryodraco antarcticus

2.3 主成分分析

對兩種冰魚耳石的77個傅里葉諧值進行主成分分析，結果顯示，裘氏鱷頭冰魚和南極小帶腭魚矢耳石參數值的前10個主成分累計貢獻率已達到69.74%，其中第一因子的貢獻率為15.1%，第二因子的貢獻率為11.4%。依據兩種南極冰魚耳石形態(tài)的77個傅里葉特征系數指標所獲的第一及第二主成分因子散點圖（圖2）可以看出，兩種冰魚耳石在第二因子方向上區(qū)分明顯，第一因子和第二因子之間僅有少量重疊，區(qū)分效果相對較好。

2.4 判別分析

用逐步判別分析法對兩種冰魚耳石進行分類，由77個傅里葉諧值中選出14個極顯著性變量（P＜0.01）的傅里葉諧值，納入判別方程。通過Fisher線性判別函數，對這14個極顯著性變量建立判別方程，將兩種南極冰魚耳石樣本中篩選出的傅里葉諧值代入上述Fisher判別函數中，則該樣本歸入所得Y值較大的函數為其所對應的類別。由初始判別結果可知，裘氏鱷頭冰魚和南極小帶腭魚的判別正確率均為100%。南極小帶腭魚交叉驗證的結果與初始判別結果不相同，原因是一個樣本數據與其他驗證樣本數據產生較大誤差，但并未影響該分析結果的可靠性，判別分析總體正確率為98.78%（表6）。利用隨機森林方法對主成分分析中貢獻率最高的前10個成分進行深入研究，結果顯示，訓練樣本的總體判別正確率為96.12%，而預測樣本的總體判別正確率則達到了91.67%。

圖2 兩種南極冰魚耳石外型傅里葉諧值第一主成分和第二主成分因子分布圖Fig.2 The 1st and 2nd principal components on Fourier harmonics for otolith morphological parameters of two icefishes

表6 基于逐步判別分析和隨機森林分析的裘氏鱷頭冰魚和南極小帶腭魚耳石判別分析Tab.6 Classification of otolith morphology for Champsocephalus gunnari and Cryodraco antarcticus based on stepw ise discrim inant analysis and random forest

3 討論

3.1 耳石形態(tài)學

從通過公式轉換得到的7項耳石形態(tài)學指標來看，南極小帶腭魚和裘氏鱷頭冰魚有近一半的形態(tài)學指標無顯著性差異，而剩下的指標雖存在顯著性差異，但通過視覺觀察無法得出可靠的分類依據。因此，傳統(tǒng)的形態(tài)學測量法并不能清晰、有效地區(qū)分這兩種冰魚耳石特征差異。

根據兩種冰魚體長與耳石形態(tài)參數間的函數關系可知，兩種冰魚耳石的大小隨體長的增加而增加，呈正相關。關于魚類體長與耳石形態(tài)參數的最適函數方程模擬中，南極小帶腭魚體長與各個耳石形態(tài)參數的最適函數均為對數函數，雖然方差顯示兩者之間存在顯著的相關關系，但擬合效果并不佳（R2＜0.5）。其原因可能為樣本量較少、體長較為集中（體長11.0～23.8 cm），而測量的耳石形態(tài)參數范圍過窄所致。通過觀察兩種冰魚體長和耳石形態(tài)參數的函數關系可以發(fā)現，南極小帶腭魚的耳石大小會隨體長的增長而增大，但至生長后期，耳石的增長速度逐漸減緩；而裘氏鱷頭冰魚耳石大小隨體長的增長變化較為穩(wěn)定。此外，由于不同世代魚類個體的耳石形態(tài)特征可能受生物環(huán)境因素影響而存在差異，因此有必要分析耳石形態(tài)變量的年齡間差異［19］。

耳石傳統(tǒng)形態(tài)學測量存在諸多局限性，如取樣的范圍和個體大小的篩選等均會對魚體外型參數（體長、體質量等）與耳石形態(tài)參數間的函數擬合產生較大的影響。例如，裘氏鱷頭冰魚的耳石長和體長的關系，本文擬合函數為SL=5.699 6e0.9917OL（R2=0.684 9），這與WILLIAMS和MCELDOWNEY［20］對南極赫德島附近水域（SL=96.67OL-20.02，R2=0.96）、HECHT［21］對凱爾蓋朗群島、南喬治亞島等多個水域（SL=12.55OL0.95，R2=0.81）以及魏聯(lián)等［16］對南設得蘭群島水域（SL=19.364OL0.4119，R2=0.13）裘氏鱷頭冰魚耳石長與體長的關系均有所差異。產生這種差異的因素較多，如不同海域溫、鹽等海洋環(huán)境以及攝食來源等生物環(huán)境均對耳石生長可能會產生影響。而當采樣海域相同或接近時，樣本的體長范圍亦影響兩者之間的關系［22］。

3.2 耳石外型判別分析

魚類耳石體積微小且形態(tài)多樣，邊緣多為不規(guī)則凸起和凹陷；因此，傳統(tǒng)形態(tài)學無法精確測量耳石邊緣的微小變化［23-24］，而這些微小的變化正是判別耳石形態(tài)是否存在多樣性的關鍵因素。因此，本文在傳統(tǒng)形態(tài)學測量的基礎上，又采用多種判別分析進行了進一步分析。主成分分析結果顯示，裘氏鱷頭冰魚和南極小帶腭魚耳石在第二因子上可進行較好的區(qū)分。雖然兩種冰魚耳石外型的兩個主成分呈現聚攏，但可以發(fā)現，裘氏鱷頭冰魚耳石外型的主成分包圍在南極小帶腭魚耳石外型各主成分的外部，且第一主成分和第二主成分間僅有少量重疊，整體區(qū)分效果較好。判別分析結果顯示，裘氏鱷頭冰魚得到的判別正確率為100%，南極小帶腭魚判別正確率為97.56%，判別效果較為理想?；陔S機森林進一步驗證分析的結果顯示，訓練樣本的判別正確率為96.12%，而預測樣本的判別正確率則達到了91.67%，總體略低于逐步判別分析法，原因可能是兩種冰魚樣本量不同以及數據量總體偏少導致。這也進一步說明，針對樣本量較小的樣本采用隨機森林分析，無法體現該方法的優(yōu)勢。

傳統(tǒng)形態(tài)學測量基于魚的外形特征及魚類耳石形態(tài)參數等更加直觀全面的信息，通過測量耳石的長度和寬度推算魚類體長等形態(tài)參數建立數學方程，用來描述其生長過程預測生長趨勢，比較種間和種群間的生長差異并提供相關漁業(yè)資源管理措施等［25］。而傅里葉分析法用數據表達耳石輪廓，分析耳石的形態(tài)變化和個體差異時，可消除因耳石位置、人工測量產生的誤差，快速準確地進行魚種判別分類。兩種方法能夠達到相輔相成的效果。本文采用了兩種判別分析方法，因數據樣本量較小，結果顯示逐步判別分析法的正確率高于隨機森林，因此，少量樣本數據時推薦采用逐步判別分析法，以縮小判別誤差，提高判別正確率；而針對龐大數據量時，則推薦采用基于隨機森林的判別分析法，以減少限制條件，提高判別效率。

隨機森林主要用于分類和回歸，其結構比較復雜，但卻具有極強的易用性，尤其在處理海量數據以及大量的自變量時更體現其優(yōu)勢［26］。隨機森林判別法需要的假設條件，如變量的獨立性、正態(tài)性等，比其他判別模型要少得多，它也不需要檢查變量的交互作用和非線性作用是否顯著［13］。因此，在當前大數據廣泛應用的背景下，隨機森林判別法作為一種可靠的判別分析方法，可適用于今后耳石外型的研究中。

致謝：感謝南極磷蝦漁業(yè)科學觀察員以及南極磷蝦漁船船長及船員在樣本收集過程中提供的幫助。本研究還得到了上海海洋大學大學生創(chuàng)新項目以及“優(yōu)秀本科生進實驗室”項目的部分資助。