王吳彬 童 飛 KHAN Mueen Alam 張雅軒 賀建波郝曉帥 邢光南 趙團(tuán)結(jié) 蓋鈞鎰,*

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所 / 國家大豆改良中心 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大豆生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(綜合) / 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 江蘇作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇南京 210095; 2江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 江蘇徐州 221131

大豆[Glycine max(L.) Merr.]是重要的植物蛋白質(zhì)和油料作物, 近年來在世界上迅速發(fā)展。地球上41%的陸地面積屬于干旱地區(qū)[1], 即使?jié)駶櫯c半濕潤地區(qū), 由于氣候變化問題, 季節(jié)性干旱也經(jīng)常發(fā)生[2]。干旱或持續(xù)缺水是限制大豆生長發(fā)育及產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)的最重要環(huán)境因素。溫室及田間研究表明, 水分脅迫能使大豆產(chǎn)量降低 24%～50%[3-4], 嚴(yán)重情況下甚至絕收。因而, 解析大豆耐旱性的遺傳機(jī)制, 具有重要的育種價(jià)值。

干旱可發(fā)生在大豆生長發(fā)育的不同階段, 包括苗期、開花期和鼓粒期等。苗期耐旱性鑒定具有試驗(yàn)周期短的特點(diǎn), 能有效加快耐旱性遺傳研究及育種利用進(jìn)程。耐旱性評(píng)價(jià)方法有多種, 包括田間鑒定法[5]、干旱棚盆栽法[6]、實(shí)驗(yàn)室法[7](水培法和高滲溶液法等)等。耐旱性評(píng)價(jià)指標(biāo)包括株高、干重等生長性狀和葉片相對(duì)含水量和脯氨酸含量等生理生化性狀等。

在水分脅迫下, 植物適應(yīng)逆境, 主要通過積累大量有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的滲透勢(shì), 保護(hù)酶、蛋白質(zhì)和生物膜系統(tǒng)[8]。有機(jī)物質(zhì)以脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿甘露醇為主, 其中, 脯氨酸是一種溶解度高的小分子滲透物質(zhì), 具有良好的水合性, 在植物受到逆境環(huán)境時(shí)能夠大量積累, 可有效減少植物體內(nèi)水分散失, 實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和組織的保水或吸水, 抑制逆境對(duì)植物細(xì)胞膜透性的破壞, 同時(shí)提高抗氧化酶的活性, 從而減輕逆境造成的傷害[9]。目前, 脯氨酸含量是植物抗逆生理生化研究中通用的一項(xiàng)重要指標(biāo)[10]。

由于大豆耐旱性易受環(huán)境影響, 表型鑒定困難, 導(dǎo)致了其遺傳研究滯后于其他性狀。截止目前, SoyBase網(wǎng)址(https://www.soybase.org/)共收錄88個(gè)耐旱性QTL, 其中62個(gè)QTL來自于9個(gè)不同雜交組合衍生的重組自交系群體, 另外26個(gè)QTL是通過不同群體QTL元分析獲得, 這些QTL分布在除15號(hào)染色體以外的所有染色體上, 其中12號(hào)和17號(hào)染色體上分布的QTL最多, 可能攜帶主效耐旱性位點(diǎn), 具體信息見表1。

為解析大豆苗期耐旱性的遺傳基礎(chǔ), 前期研究構(gòu)建了一套來自蒙8206 (Meng 8202, M)、通山薄皮黃豆甲(Tongshanbopihuangdoujia, T)和正陽白毛平頂(Zhengyangbaimaopingding, Z)的巢式關(guān)聯(lián)作圖群體(population from Meng 8202, Tongshanbopihuangdoujia and Zhengyangbaimaopingding, MTZ), 并以根長、莖長、植株長度(根+莖)和干重等生長性狀為指標(biāo), 檢測(cè)到 157個(gè)耐旱性 QTL[19-20]。在此基礎(chǔ)上, 本研究將耐旱指標(biāo)拓展到生理性狀, 在 15% PEG-6000模擬干旱條件下, 以脯氨酸含量為基礎(chǔ)的根部水壓脅迫耐逆指數(shù)為指標(biāo), 分別在春季和夏季 2個(gè)環(huán)境下評(píng)價(jià) MTZ群體苗期耐旱性; 然后, 聯(lián)合 MTZ群體表型與基因型, 利用限制性二階段多位點(diǎn)全基因組關(guān)聯(lián)分析方法(restricted two-stage multilocus genomewide GWAS, RTM-GWAS), 解析了MTZ群體苗期根部水壓脅迫耐逆指數(shù)的遺傳體系, 以期發(fā)掘控制大豆苗期耐旱性的主要位點(diǎn)及其候選基因, 為大豆耐旱性分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

為解析大豆耐旱性的遺傳基礎(chǔ), 課題組前期構(gòu)建了一套以敏旱材料蒙 8206 (M, 熟期組 V)為共同母本, 耐旱材料通山薄皮黃豆甲(T, 熟期組 VI)和正陽白毛平頂(Z, 熟期組 V)為父本的巢式關(guān)聯(lián)作圖群體MTZ。MTZ群體共包含409個(gè)重組自交系, 其中285份家系來自蒙 8206×通山薄皮黃豆甲(M8206 ×Tongshanbopihuangdoujia, MT), 124份來自蒙8206×正陽白毛平頂(M8206 × Zhengyangbaimaopingding,MZ)。MT和 MZ群體構(gòu)建方法如下: 以蒙 8206為共同母本, 分別與通山薄皮黃豆甲和正陽白毛平頂雜交, 獲得F1, 后經(jīng)單籽傳法自交至7代, 得到重組自交系群體。上述材料均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心種質(zhì)資源庫提供。

表1 文獻(xiàn)報(bào)道的部分大豆耐旱性位點(diǎn)信息Table 1 Information of drought tolerance QTLs reported in the literatures

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及群體表型評(píng)價(jià)

試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心溫室中進(jìn)行, 采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 3次重復(fù), 分別在春季(2017年4月, 溫度大約6～24℃)和夏季(2017年6月, 溫度大約21～32℃) 2個(gè)環(huán)境下進(jìn)行。鑒定方法如下: 首先, 剪裁邊長約20 cm的正方形濾紙, 選取MTZ群體及其3個(gè)親本各7粒種子, 均勻排列在濾紙上方三分之一處, 勻速卷動(dòng)濾紙, 保證種子不移位, 卷好后分上中下 3處將紙卷用膠帶固定, 然后垂直插入500 mL (直徑9 cm, 高11 cm)的塑料杯中,杯中注水; 選擇長勢(shì)一致的大豆植株, 每個(gè)處理留2株, 為保證不傷及試驗(yàn)所用幼苗, 將其余幼苗用剪刀剪除; 待植株生長至V1期(第1片三出復(fù)葉展開)時(shí), 對(duì)幼苗進(jìn)行含有 15% PEG-6000 (聚乙二醇)的Hoagland營養(yǎng)液脅迫處理, 營養(yǎng)液每周更換 1次;待植株長到 V2期(第 2片三出復(fù)葉展開)時(shí), 采取第 2片三出復(fù)葉中間小葉進(jìn)行葉片脯氨酸含量測(cè)定。

采用酸性茚三酮顯色法測(cè)定葉片脯氨酸含量[21-22], 根據(jù)耐旱親本通山薄皮黃豆甲和正陽白毛平頂葉片脯氨酸含量均值計(jì)算每份材料的根部水壓脅迫耐逆指數(shù)(RHSTI), 以增加不同重復(fù)和環(huán)境間表型數(shù)據(jù)的可比性, 計(jì)算公式為 RHSTIijk=LPCijk/(LPCijT+ LPCijZ)/2, RHSTIijk代表第i個(gè)環(huán)境、第j次重復(fù)中第k個(gè)家系的根部水壓脅迫耐逆指數(shù),LPCijk表示第i個(gè)環(huán)境、第j次重復(fù)中第k個(gè)家系的葉片脯氨酸含量; LPCijT表示第i個(gè)環(huán)境、第j次重復(fù)中耐旱親本通山薄皮黃豆甲的葉片脯氨酸含量;LPCijT表示第i個(gè)環(huán)境、第j次重復(fù)中耐旱親本正陽白毛平頂?shù)娜~片脯氨酸含量。RHSTI值越大, 表示材料越耐旱。

1.3 MTZ群體基因型鑒定

采用 CTAB法從大豆葉片中提取大豆基因組DNA, 經(jīng)TaqI酶切后, 選取 400～700 bp之間的DNA片段, 利用Illumina HiSeq 2000測(cè)序儀的多元鳥槍法基因分型策略[23], 測(cè)定 DNA片段兩端堿基序列, 可讀取長度90 bp。采用SOAP2軟件[24]將測(cè)序獲得的原始測(cè)序reads與Williams 82參考基因組(Glyma.Wm82.a1.v 1.1)進(jìn)行比對(duì)。利用基于貝葉斯模型的realSFS軟件[25]進(jìn)行SNP基因型的鑒定。用以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MTZ群體的SNP進(jìn)行篩選, 缺失和雜合率≤30%, 最小等位基因頻率≥1% (如果存在第 3個(gè)或更多個(gè)等位基因時(shí), 則用缺失等位基因替換)。通過RAD-seq測(cè)序, MZ和MT群體最終分別獲得66,677和55,958個(gè)SNP, 用于后續(xù)劃分SNP連鎖不平衡區(qū)段(SNP linkage disequilibrium block,SNPLDB)標(biāo)記。此部分工作由深圳華大基因科技有限公司完成。

對(duì)MTZ群體SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格過濾, 僅保留基因分型率 80%以上的 SNP標(biāo)記, 通過并集方式, 把MTZ群體的 SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行合并, 獲得 55,936個(gè)SNP。使用fastPHASE軟件[26]對(duì)缺失SNP進(jìn)行填補(bǔ),利用Haploview軟件[27]根據(jù)MTZ群體的55,936個(gè)SNP標(biāo)記劃分單倍型區(qū)段, 使用默認(rèn)設(shè)置的置信區(qū)間法定義區(qū)段, 最大距離和最小 MAF分別設(shè)置為200 kb和0.01。位于1個(gè) LD (linkage disequilibrium)區(qū)段內(nèi)緊密連鎖的多個(gè) SNP, 整合在一起作為該基因組區(qū)域的一段序列, 劃分為1個(gè)SNPLDB標(biāo)記?；谝陨戏椒? MTZ群體共檢出55,936個(gè)SNP組成的6137個(gè)SNPLDB標(biāo)記用于后續(xù)分析。該群體基因型已應(yīng)用于以根長、莖長、植株長度(根+莖)和干重等生長性狀為指標(biāo)的耐旱性遺傳研究[19-20]。

1.4 MTZ群體全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用賀建波等[28]提出的限制性二階段多位點(diǎn)全基因組關(guān)聯(lián)分析方法(RTM-GWAS)進(jìn)行大豆根部水壓脅迫耐逆指數(shù)遺傳解析。所用分子標(biāo)記是MTZ群體的6137 SNPLDB, 表型數(shù)據(jù)是2個(gè)環(huán)境下大豆根部水壓脅迫耐逆指數(shù)(含每個(gè)環(huán)境下的 3次重復(fù)數(shù)據(jù))。RTM-GWAS關(guān)聯(lián)分析分2個(gè)階段進(jìn)行, 在第1階段, 基于簡單線性模型(simple linear model)進(jìn)行單位點(diǎn)關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)(single-locus association test), 對(duì)SNPLDB標(biāo)記進(jìn)行初步篩選(從6137個(gè)SNPLDB中選出 2708個(gè)); 在第 2階段, 對(duì)第 1階段篩選到的2708個(gè)顯著標(biāo)記, 利用多位點(diǎn)逐步回歸模型進(jìn)行篩選, 并估計(jì)等位變異的效應(yīng)。在這2個(gè)階段中, 將基于SNPLDB標(biāo)記的個(gè)體間遺傳相似系數(shù)矩陣的前10個(gè)特征向量作為協(xié)變量進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)控制。為檢測(cè)到更多的候選關(guān)聯(lián)位點(diǎn), 初步篩選標(biāo)記和多位點(diǎn)逐步回歸關(guān)聯(lián)分析時(shí), 顯著水平分別為P=0.05和P=0.01, 遺傳力控制在37.9%以內(nèi)。

1.5 MTZ群體QTL-等位變異矩陣構(gòu)建

將RTM-GWAS關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到的QTL及等位變異效應(yīng)構(gòu)建 QTL-等位變異(QTL-allele)矩陣, 構(gòu)建方法如下: 以 409個(gè)家系為橫坐標(biāo), 以關(guān)聯(lián)SNPLDB位點(diǎn)為縱坐標(biāo), 每個(gè)單元格表示某一家系在特定關(guān)聯(lián)標(biāo)記上的等位變異效應(yīng)。為簡化表示該矩陣, 用不同顏色梯度來表示等位變異效應(yīng)值的變化趨勢(shì), 紅色表示增效等位變異, 逐步過渡到藍(lán)色來表示減效等位變異。

1.6 大豆苗期耐旱性候選基因分析

以課題組前期鑒定的耐旱材料光澤黃莢豆為材料, 用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)至V1期, 后用含有15%PEG-6000的Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行脅迫處理12 h, 分別取處理前后的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 測(cè)序深度為5倍。該測(cè)序工作委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。聯(lián)合關(guān)聯(lián)分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果, 將位于QTL±500 kb區(qū)間內(nèi)(衰減距離)的差異表達(dá)基因認(rèn)為本研究檢測(cè)到的耐旱性候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆MTZ群體及其親本根部水壓脅迫耐逆指數(shù)表現(xiàn)

在春季和夏季2個(gè)環(huán)境中, 3個(gè)親本蒙8206、正陽白毛平頂和通山薄皮黃豆甲的根部水壓脅迫耐逆指數(shù)RHSTI分別為0.35與0.17、1.05與1.04和0.95與 0.96, 共同親本蒙 8206較其他 2個(gè)親本 RHSTI存在顯著差異, 且較低, 說明其耐旱性較弱(表2和圖1)。在春、夏2個(gè)環(huán)境下, MTZ群體RHSTI均表現(xiàn)連續(xù)分布, 且具有較高遺傳力, 分別為 97.2%和97.9%, 表明PEG模擬干旱條件下大豆RHSTI屬于多基因控制的數(shù)量性狀。在春季環(huán)境下, MTZ群體RHSTI平均值為 0.69, 變幅為 0.11～2.94; 在夏季環(huán)境下, RHSTI均值為 0.65, 變幅為 0.03～1.93, 表明MTZ群體RHSTI存在廣泛變異, 適合大豆耐旱性遺傳解析。在 2個(gè)不同環(huán)境下, 誤差變異系數(shù)分別為13.2%和 12.1%, 均低于 15.0%, 說明本研究誤差控制較好。

表2 MTZ群體及其親本根部水壓脅迫耐逆指數(shù)RHSTI的描述性統(tǒng)計(jì)Table 2 Descriptive statistics of root hydraulic stress tolerance index (RHSTI) in the MTZ population

對(duì)2個(gè)不同環(huán)境下MTZ群體的RHSTI進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn), 群體在 RHSTI上表現(xiàn)連續(xù)分布, 均值為 0.68, 變幅為 0.09～2.80, 同樣顯示了廣泛的表型變異。聯(lián)合方差分析結(jié)果顯示, 家系以及家系×環(huán)境間均存在極顯著差異。在RHSTI上, 家系遺傳力為37.9%, 家系與環(huán)境互作遺傳力為 60.1%, 這與葉片脯氨酸含量在春季與夏季間差異較大相符, 可能與不同環(huán)境下氣溫差異較大有關(guān)(表3)。

2.2 MTZ群體根部水壓脅迫耐逆指數(shù) QTL-等位變異(QTL-allele)體系解析

聯(lián)合MTZ群體2個(gè)環(huán)境下的RHSTI表型數(shù)據(jù)和 6137個(gè) SNPLDB標(biāo)記基因型數(shù)據(jù), 通過RTM-GWAS方法, 在遺傳力控制在37.9%以內(nèi)的情況下, 共檢測(cè)到了45個(gè)與根部水壓脅迫耐逆指數(shù)顯著相關(guān)的 QTL, 顯著水平(-lgP)變幅為 11.7～73.0,12號(hào)染色體上的位點(diǎn)RHSTI12.2顯著性最高(圖2-A,B); 這些位點(diǎn)中, 有34個(gè)位點(diǎn)與環(huán)境存在顯著互作(QEI, QTL × Environment interaction), 具體結(jié)果見表4。檢測(cè)到的 QTL分布在大豆 Gm01、Gm02、Gm03、Gm04、Gm06、Gm07、Gm08、Gm09、Gm10、Gm11、Gm12、Gm13、Gm14、Gm15、Gm17、Gm18、Gm19和Gm20等18條染色體上, 每條染色上攜帶有 1個(gè)(Gm01、Gm04、Gm08和 Gm20)至 4個(gè)(Gm02、Gm09、Gm10和 Gm19) QTL。這些位點(diǎn)總計(jì)解釋37.58%的表型變異, 單個(gè)位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率變幅為0.46%～3.09%; 其中有 7個(gè) QTL的貢獻(xiàn)率≥1%, 歸為大貢獻(xiàn) QTL, 應(yīng)為控制大豆耐旱性的主要位點(diǎn),累計(jì)解釋12.00%的表型變異; 另外38個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率＜1%, 歸為小貢獻(xiàn) QTL, 累計(jì)解釋 25.58%的表型變異。這些QTL中, 有33個(gè)位點(diǎn)與環(huán)境存在顯著互作(QEI位點(diǎn)), 單個(gè)QEI的表型貢獻(xiàn)率變幅為0.06～1.70, 互作累計(jì)可以解釋 12.50%的表型變異;其中3個(gè)為大貢獻(xiàn)位點(diǎn), 累積貢獻(xiàn)率4.35%, 30個(gè)為小貢獻(xiàn)位點(diǎn), 累積貢獻(xiàn)率8.15%。根據(jù)遺傳解析結(jié)果,RHSTI的遺傳體系可以分解為3部分, 包括: 45個(gè)主效QTL, 可以解釋37.58%的表型變異; 33個(gè)QTL與環(huán)境互作效應(yīng), 可以解釋 12.50%的表型變異; 另外37.9% (h2)+60.11% (互作遺傳力)-37.58%-12.50%=47.93%的表型變異, 可能是由未被檢測(cè)到的微效QTL控制。鑒于本研究檢測(cè)到的QTL與環(huán)境互作效應(yīng)可能由于春季和夏季不同光溫條件引起的, 差異條件較難衡量和重復(fù), 且互作位點(diǎn)包含于主效位點(diǎn)內(nèi), 所以后續(xù)的QTL-等位變異矩陣和候選基因分析依據(jù)主效位點(diǎn)進(jìn)行。

表3 MTZ群體根部水壓脅迫耐逆指數(shù)RHSTI兩環(huán)境聯(lián)合方差分析Table 3 Joint analysis of variance of root hydraulic stress tolerance index (RHSTI) under two environments in the MTZ population

2.3 MTZ 群體根部水壓脅迫耐逆指數(shù)QTL-allele矩陣及三親本后代育種潛力

在 45個(gè)根部水壓脅迫耐逆指數(shù)QTL上, MTZ群體總共攜帶 123個(gè)等位變異, 平均每個(gè)位點(diǎn)攜帶2.73個(gè)等位變異, 變幅為 2～3個(gè)。在 123個(gè)等位變異中, 等位變異效應(yīng)變幅為-1.911～1.961; 其中, 58個(gè)為增效等位變異, 變幅為0.001～1.961, 65個(gè)為減效等位變異, 變幅為-1.911～ -0.001 (圖2-C)。根據(jù)上述結(jié)果, 本研究建立了 MTZ群體 45×409的QTL-allele矩陣, 橫坐標(biāo)代表409份半同胞家系, 縱坐標(biāo)表示45個(gè)QTL位點(diǎn), 每個(gè)位點(diǎn)上的等位變異用其效應(yīng)值表示, 顏色深淺表示等位變異效應(yīng)大小(圖2-D)。隨著家系根部水壓脅迫耐逆指數(shù)的升高, 家系攜帶增效等位變異有升高的趨勢(shì), 并且每個(gè)家系均攜帶有增效的等位變異和減效等位變異, 表明家系間具有較高的重組潛力。

?

根據(jù)遺傳解析結(jié)果, 在本研究檢測(cè)到的45個(gè)主效位點(diǎn)上, 3個(gè)親本通山薄皮黃豆甲、蒙8206和正陽白毛平頂分別攜帶有24、21和21個(gè)增效等位變異, 另外21、24和24個(gè)為減效等位變異, 其RHSTI值分別為 1.05、0.26和 0.95。不考慮互作, 只考慮基因加性效應(yīng)的情況下, 3個(gè)親本的最優(yōu)重組個(gè)體即在45個(gè)位點(diǎn)上均攜帶最優(yōu)等位變異, 其RHSTI值可以高達(dá)18.92, 顯示了巨大的超親潛力(圖2-E)。

2.4 大豆根部水壓脅迫耐逆指數(shù)相關(guān)候選基因分析

聯(lián)合大豆苗期PEG脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 在根部水壓脅迫耐逆指數(shù)相關(guān)位點(diǎn)及其附近500 kb區(qū)間內(nèi)共篩選到 38個(gè)差異表達(dá)基因, 其中 24個(gè)基因上調(diào)表達(dá), 相對(duì)表達(dá)量變幅 2.02～4,002,450.00倍; 14個(gè)基因下調(diào)表達(dá), 相對(duì)表達(dá)量變幅 0.04～0.50。位于RHSTI9.1位點(diǎn)上的候選基因Glyma.09G051700在PEG處理前后表達(dá)量差異高達(dá) 4,002,450.00倍, 其編碼一個(gè)未知功能的蛋白。根據(jù)生物學(xué)功能, 38個(gè)耐旱候選基因可歸為7類, 包括ABA響應(yīng)因子、逆境響應(yīng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育因子、蛋白代謝因子、未知功能和其他, 分別包含5、17、3、9、8、2和8個(gè)候選基因, 其中逆境響應(yīng)因子和轉(zhuǎn)錄因子和發(fā)育因子是最大的 3類。表明, 大豆耐旱性是一個(gè)復(fù)雜性狀, 有多個(gè)具有不同功能的候選基因共同控制。具體結(jié)果見表5。

表5 轉(zhuǎn)錄組與GWAS相結(jié)合的根部水壓脅迫耐逆指數(shù)RHSTI候選基因分析Table 5 Analysis the candidate genes of root hydraulic stress tolerance index (RHSTI) combined the results of GWAS and RNA-seq

(續(xù)表5)

3 討論

3.1 大豆耐旱性遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜, 不同指標(biāo)、不同群體具有不同但相似的遺傳體系

植物耐旱性評(píng)價(jià)主要有生理生化指標(biāo)和生長形態(tài)指標(biāo)兩大類。生理生化指標(biāo)包括脯氨酸含量、丙二醛含量、過氧化物氣化酶含量和電導(dǎo)率等, 其是植物受到外界脅迫時(shí)的直接反應(yīng), 因表型調(diào)查困難,群體較大時(shí)較難進(jìn)行; 生長指標(biāo)較生理指標(biāo)穩(wěn)定,表型鑒定成本低, 是植物耐旱性的最終反映。因而,植物耐旱性是復(fù)雜的數(shù)量性狀, 僅憑單個(gè)指標(biāo)很難對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。脯氨酸含量作為植物抗逆生理生化研究中的一項(xiàng)重要指標(biāo), 已被用于水稻[29]、小麥[30]、玉米[31]等作物耐逆QTL定位研究中, 然而在大豆中文獻(xiàn)報(bào)道較少。

為解析大豆耐旱性的遺傳基礎(chǔ), 本研究前期構(gòu)建了由2套重組自交系群體組成的NAM群體MTZ,并以生長指標(biāo)評(píng)價(jià)了其耐旱性, 檢測(cè)到 157個(gè)耐旱性QTL[19-20]。本研究將耐旱性指標(biāo)拓展到生理指標(biāo)脯氨酸含量, 評(píng)價(jià)了MTZ群體根部水壓脅迫耐逆指數(shù), 檢測(cè)到 45個(gè) QTL位點(diǎn), 包含 123個(gè)等位變異,這些位點(diǎn)包括7個(gè)大貢獻(xiàn)QTL和38個(gè)小貢獻(xiàn)QTL,累計(jì)解釋37.58%的表型變異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大部分位點(diǎn)與環(huán)境存在互作, 互作可以解釋 12.50%的表型變異。與 Mueen等[19-20]利用MTZ群體檢測(cè)到的相對(duì)根長、相對(duì)莖長、相對(duì)植株長度(根+莖)和相對(duì)干重等生長指標(biāo)耐旱性 QTL結(jié)果相整合, 共檢測(cè)到 18個(gè)QTL簇與多個(gè)指標(biāo)相關(guān), 分布在大豆3號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、10號(hào)、13號(hào)、14號(hào)、15號(hào)、17號(hào)、18號(hào)、19號(hào)和20號(hào)染色體上, 其中有3個(gè)QTL簇所包含的位點(diǎn)均為大貢獻(xiàn) QTL, 具體見表6。這些QTL簇, 尤其與多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)的QTL簇應(yīng)為控制大豆耐旱性的主要染色體區(qū)段。上述結(jié)果說明, 大豆耐旱性是一個(gè)復(fù)雜性狀, 不同指標(biāo)具有不同的遺傳體系, 共有位點(diǎn)僅占較小部分[16/(45+157)]。

與前人檢測(cè)到的耐旱性QTL相比, 本研究檢測(cè)到的45個(gè)QTL位點(diǎn)中, 有8個(gè)位點(diǎn)與前人耐旱性位點(diǎn)定位結(jié)果一致(表4)。RHSTI10.2和RHSTI10.3已被前人在“Benning/PI416937”[13]群體中已檢測(cè)到;RHSTI14.2和RHSTI15.1位點(diǎn)已被前人在“Benning/PI416937”[13]群體中以葉片萎蔫程度為指標(biāo)檢測(cè)到。RHSTI17.1已被前人在“科豐 1號(hào)/南農(nóng) 1138-2”[14]、“KS4895/Jackson”[12]和“93705 KS4895/Jackson”[13]等群體中檢測(cè)到, 另外 3個(gè)位點(diǎn)RHSTI2.2、RHSTI11.1和RHSTI11.2已被前人在多個(gè)群體 QTL元分析[18]中檢測(cè)到。表明, 大豆耐旱性是一個(gè)復(fù)雜數(shù)量性狀, 遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜, 不同的群體具有不能的遺傳基礎(chǔ); 能被多個(gè)群體檢測(cè)到的位點(diǎn)僅占少數(shù),應(yīng)為控制大豆耐旱性最為主要的QTL。

表6 多個(gè)耐旱指標(biāo)評(píng)價(jià)MTZ群體檢測(cè)到的QTL簇(±500 kb)Table 6 QTL clusters of multiple drought tolerance indicators within 500 kb in MTZ population

3.2 大豆耐旱性涉及一套具有不同功能的候選基因體系

借助高密度的分子標(biāo)記, 本研究可以將根部水壓脅迫耐逆指數(shù)位點(diǎn)定位到較小的染色體區(qū)段內(nèi),便于候選基因的預(yù)測(cè)。結(jié)合PEG脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),共預(yù)測(cè)到38個(gè)耐旱性候選基因, 可歸為7類, 包括ABA響應(yīng)因子、逆境響應(yīng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育因子、蛋白代謝、未知功能和其他, 其中逆境響應(yīng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育因子是最大的3類。38個(gè)根部水壓脅迫耐逆指數(shù)候選基因中, 有 6個(gè)基因位于大貢獻(xiàn)位點(diǎn)上, 其中RHSTI2.2位點(diǎn)上的候選基因Glyma.02G196500屬于 BLH1類轉(zhuǎn)錄因子, 參與ABA刺激、耐鹽和生長發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過程;RHSTI9.3位點(diǎn)上的候選基因Glyma.09G071600編碼中茉莉酸信號(hào)蛋白, 參與了ABA信號(hào)、缺水響應(yīng)和花的發(fā)育等 27個(gè)生物學(xué)過程;RHSTI11.2位點(diǎn)上的候選基因Glyma.11G207000參與應(yīng)對(duì)高溫和蛋白磷酸化等生物學(xué)過程;RHSTI15.1位點(diǎn)上的候選基因Glyma.15G222200參與了植物應(yīng)對(duì)缺水的生物學(xué)過程;RHSTI18.1位點(diǎn)上的候選基因Glyma.18G018600參與了應(yīng)對(duì)高溫和低磷等生物學(xué)過程。表明, 大豆耐旱性是一個(gè)復(fù)雜性狀, 有多個(gè)具有不同功能的候選基因共同控制, 位于大貢獻(xiàn)位點(diǎn)上的候選基因應(yīng)為控制大豆耐旱性的主要基因, 具有深入研究價(jià)值。

4 結(jié)論

PEG模擬干旱條件下, MTZ群體及其親本在根部水壓脅迫耐逆指數(shù)上存在顯著差異, 且群體表型變異豐富。根部水壓脅迫耐逆指數(shù)在單個(gè)環(huán)境下具有較高遺傳力, 在不同環(huán)境間存在較強(qiáng)互作, 說明MTZ群體根部水壓脅迫耐逆指數(shù)受遺傳和環(huán)境的共同影響。利用限制性二階段多位點(diǎn)全基因組關(guān)聯(lián)分析方法, 對(duì)MTZ群體遺傳解析發(fā)現(xiàn), 根部水壓脅迫耐逆指數(shù)遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜, 由小貢獻(xiàn)和大貢獻(xiàn)的位點(diǎn)共同控制, 同時(shí)位點(diǎn)與環(huán)境間存在顯著互作。對(duì)定位區(qū)間的候選基因進(jìn)行注釋, 共預(yù)測(cè)到38個(gè)候選基因, 涉及ABA響應(yīng)因子、逆境響應(yīng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育因子、蛋白代謝、未知功能和其他等不同功能,其中逆境響應(yīng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、發(fā)育因子是最大的3類, 位于大貢獻(xiàn)位點(diǎn)的 6個(gè)候選基因參與ABA、逆境和生長發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)過程, 具有重要研究價(jià)值。上述研究結(jié)果表明大豆耐旱性是一個(gè)由多位點(diǎn)、多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀, 且與環(huán)境存在互作, 遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜。